亞低溫對(duì)顱腦創(chuàng)傷后受體相互作用蛋白激酶-1及其壞死性凋亡通路表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：本實(shí)驗(yàn)利用可控性皮質(zhì)損傷裝置（CCI）裝置成功建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，及可控性細(xì)胞損傷裝置（CIC-II）裝置成功建立顱腦創(chuàng)傷的細(xì)胞模型并運(yùn)用此模型進(jìn)行：(1)探討亞低溫對(duì)顱腦創(chuàng)傷（TBI）后大鼠腦組織受體相互作用蛋白激酶-1（RIPK-1）表達(dá)的影響。（2）對(duì)RIPK-1介導(dǎo)的壞死性凋亡通路中神經(jīng)細(xì)胞壞死性凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行探索并揭示重要蛋白在通路中的相互作用。（3）研究亞低溫對(duì)壞死性凋亡通路保護(hù)作用的分子機(jī)制。（4）FADD

2、在RIPK-1介導(dǎo)的壞死性凋亡通路中的作用。
　　研究?jī)?nèi)容與方法：本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：即動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分。實(shí)驗(yàn)一：利用可控性皮質(zhì)損傷裝置（CCI）建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型并給予多種方法系統(tǒng)評(píng)價(jià)造模準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)二：應(yīng)用可控性細(xì)胞損傷裝置（CIC-II）裝置成功建立顱腦創(chuàng)傷的細(xì)胞模型并就細(xì)胞形態(tài)學(xué)等特征進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)研究。
　　實(shí)驗(yàn)一：健康成年Wistar大鼠40只，將其隨機(jī)分成4組：Sham組（假手術(shù)）開(kāi)骨窗不予打擊、傷后

3、不給予亞低溫治療，Sham+HT組（假手術(shù)+亞低溫）開(kāi)骨窗不予打擊而后亞低溫干預(yù)8小時(shí)，TBI組（手術(shù)）開(kāi)骨窗后應(yīng)用CCI裝置打擊致傷，參數(shù)設(shè)置為：速率（v）4m/s，深度（d）2mm，持續(xù)時(shí)間（t）120ms， TBI+HT組（手術(shù)+亞低溫）開(kāi)骨窗，CCI打擊致傷（前后打擊參數(shù)保持一致），傷后采取亞低溫治療時(shí)間統(tǒng)一定為8小時(shí)，待動(dòng)物蘇醒后，在傷后1天和2天進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷綜合評(píng)分（n=10），后進(jìn)行親神經(jīng)特殊染料（甲苯胺藍(lán)）的腦組織染

4、色實(shí)驗(yàn)；Western-blot測(cè)定大鼠皮層 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, TRAIL, and FasL的表達(dá)；Real-time PCR測(cè)定大鼠皮層 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, TRAIL, and FasL的mRNA表達(dá)；腦組織HE染色、免疫組化染色；腦組

5、織DNA免疫熒光實(shí)驗(yàn)；透射電子顯微鏡檢測(cè)腦組織壞死后亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化；Fluoro-Jade.C(FJC)腦組織染色；大鼠腦組織血流量測(cè)定。
　　實(shí)驗(yàn)二：SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)用 CIC-II梯度打擊SH-SY5Y并評(píng)價(jià)，常規(guī)培養(yǎng)胰酶消化SH-SY5Y細(xì)胞，準(zhǔn)備生物硅膠模培養(yǎng)皿，每個(gè)生物硅膠模培養(yǎng)孔內(nèi)加入2ml細(xì)胞懸液，混勻，置入培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)24h，以使之貼壁生長(zhǎng)，次日取出生物硅膠模培養(yǎng)皿，置于 CIC-II儀器

6、之下，第一孔不打擊，其余各孔各打擊1-4次，打擊中不間隔；在每孔中分別加入FJC、PI、DAPI行免疫熒光染色，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞死亡情況；SH-SY5Y細(xì)胞分為四組，接種于6孔板。分別為假手術(shù)組（Sham組）：不予CIC-II打擊、傷后不給予亞低溫干預(yù)，假手術(shù)組+亞低溫組（Sham+HT組）：不予CIC-II打擊、傷后亞低溫干預(yù)8小時(shí)，手術(shù)組（TBI組）： CIC-II打擊、傷后不予亞低溫干預(yù)，手術(shù)組+亞低溫組（TBI+HT組）

7、：CIC-II打擊、傷后給予亞低溫干預(yù)8小時(shí)，次日取出四組細(xì)胞，處理后流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。
　　結(jié)果：1.傷后24h、48h神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果：TBI+HT組較TBI組NSS評(píng)分明顯降低（P<0.01）。本實(shí)驗(yàn)提示HT治療能改善顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經(jīng)功能缺陷癥狀，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，低溫干預(yù)的遠(yuǎn)期療效呈增加態(tài)勢(shì)（*P＜0.05，**P＜0.01）；（＃＃P＜0.05）。
　　2. Real-time RT-PCR驗(yàn)證大鼠腦組織目的基因表

8、達(dá)情況：
　　根據(jù) Real-time RT-PCR結(jié)果顯示各組 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL相對(duì)表達(dá)量：與Sham組相比，其余各組大鼠腦組織中目的基因 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL mRNA表

9、達(dá)量均有不同程度的增加；TBI組及TBI+HT組mRNA表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01）； TBI組及TBI+HT組相比，亞低溫干預(yù)后，TBI+HT組大鼠腦組織中目的基因 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL mRNA表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜

10、0.01）。
　　3. Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　與Sham組相比，余大鼠腦組織中RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL表達(dá)量均有不同程度的增加；TBI組及TBI+HT組目的蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01）； TBI+HT組大鼠腦組織中目的蛋白R(shí)IP

11、K-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01）。
　　4.透射電鏡觀察大鼠TBI造模后神經(jīng)元胞核及線粒體結(jié)構(gòu):
　　Sham組腦組織超微結(jié)構(gòu)中的線粒體和胞核未見(jiàn)明顯異常改變，TBI組的神經(jīng)細(xì)胞變化主要有細(xì)胞核型不規(guī)則，胞漿內(nèi)網(wǎng)狀組織腫脹，胞漿減少，核內(nèi)染色質(zhì)邊集

12、等壞死和凋亡的特征性改變線粒體密集成簇，出現(xiàn)馬蹄形或環(huán)形扭曲，線粒體膜產(chǎn)生細(xì)小空泡，內(nèi)部線粒體嵴結(jié)構(gòu)崩解消失。
　　5. HE染色觀察大鼠皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞：
　　TBI組可見(jiàn)不同程度損傷，皮層損傷區(qū)含有大量紅細(xì)胞，在 Sham組及Sham+HT組，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及數(shù)目無(wú)明顯異常；在TBI組，皮層及海馬部位神經(jīng)細(xì)胞有損壞性改變。在TBI+HT組，紅細(xì)胞數(shù)目在皮層損傷區(qū)域有明顯降低，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損壞不明顯。
　　6.

13、 FJC染色陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)價(jià)TBI大鼠造模后神經(jīng)元變性壞死：
　　本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用FJC染色TBI后大鼠腦組織切片有明確陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。FJC染色陽(yáng)性部位切片可見(jiàn)多個(gè)綠染神經(jīng)元細(xì)胞，未行CCI打擊的大鼠腦組織FJC染色未見(jiàn)明顯陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，這種綠染的陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞在皮質(zhì)損傷周邊區(qū)域更加明顯，數(shù)量也較多。
　　7.大鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色及腦組織內(nèi) TRAIL+PARP-1+DNA免疫熒光三染結(jié)果：
　　觀察區(qū)域?yàn)榇笫髶p傷側(cè)皮層， RI

14、PK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)；TNF-α, and FasL免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于神經(jīng)元胞膜。Sham組和 Sham+HT組中 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較創(chuàng)傷組表達(dá)量低，TBI組中RIPK-1, RIPK-3, FA

15、DD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL免疫活性明顯增加，而與TBI組比較，TBI+HT組中RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL免疫活性則有不同程度上的降低。PARP-1熒光陽(yáng)性區(qū)域與DAPI重疊，提示 PARP-1為胞核內(nèi)表達(dá)，TRAIL免疫銀光染色陽(yáng)性區(qū)域集中于神經(jīng)細(xì)胞包膜。

16、r>　　8.多普勒超聲腦血流量檢測(cè)結(jié)果：
　　TBI干預(yù)后使得大鼠損傷周邊血流量(TBI組及TBI+HT組)與Sham組相比顯著下降（**P＜0.01），在TBI造模后給予亞低溫干預(yù)后，復(fù)測(cè)大鼠腦血流量，結(jié)果顯示：與 TBI組大鼠腦血流量相比，打擊損傷周邊區(qū)域皮質(zhì)的腦血流量有所增加，組間比較增加的腦血流量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P＜0.01）。
　　9.應(yīng)用CIC-II梯度打擊SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及PI免疫熒光染色：

17、>　　對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本保持不變，隨打擊次數(shù)的增加，死亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，此外，CIC-II打擊后的SH-SY5Y細(xì)胞胞體變小、變圓，伸出的軸突縮短，樹(shù)突樣突起數(shù)目減少，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)更為多樣化，提示細(xì)胞處于壞死、凋亡期，且隨打擊次數(shù)增加，這種趨勢(shì)更為明顯，進(jìn)一步的PI免疫熒光染色結(jié)果補(bǔ)充證明這一現(xiàn)象，說(shuō)明應(yīng)用CIC-II打擊SH-SY5Y細(xì)胞可以良好的復(fù)制體外TBI模型。10.應(yīng)用激光全息細(xì)胞成像系統(tǒng)（SUN-BIO M3）觀察記錄SH

18、-SY5Y各參數(shù)及PI染色應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察記錄SH-SY5Y凋亡周期：
　　應(yīng)用 SUN-BIO M3觀察記錄 SH-SY5Y細(xì)胞參數(shù)可供研究分析細(xì)胞物理特性，隨打擊次數(shù)增加，細(xì)胞死亡率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；細(xì)胞平均突起增多；細(xì)胞變得更加粗糙，后又規(guī)則以及細(xì)胞平均形狀凸率先下降又升高，細(xì)胞文理變得雜亂不規(guī)則，細(xì)胞平均厚度增加提示細(xì)胞皺縮，體積不變情況下，單個(gè)細(xì)胞厚度增加；細(xì)胞平均周長(zhǎng)變短，細(xì)胞平均不規(guī)則度下降，提示細(xì)胞突起減少，細(xì)胞匯合

19、度明顯下降，組間比較增加、減少值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05、**P＜0.01）11.流式細(xì)胞術(shù)觀察記錄SH-SY5Y細(xì)胞凋亡周期：
　　正常組(control)及正常+亞低溫組(control+HT)細(xì)胞有少量調(diào)亡，G1峰形態(tài)無(wú)明顯提前，在應(yīng)用CIC處理過(guò)的細(xì)胞應(yīng)用PI染色流式細(xì)胞術(shù)觀察記錄SH-SY5Y細(xì)胞凋亡周期時(shí)可見(jiàn)明顯的G1峰提前，即sub-G1峰，提示SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡壞死趨勢(shì)，低溫干預(yù)CIC處理過(guò)的細(xì)胞

20、后，可見(jiàn)G1峰延遲現(xiàn)象得到糾正，無(wú)明顯sub-G1峰，凋亡率為(16.8±1.27)％，其中,正常組(control)及正常+亞低溫組(control+HT)細(xì)胞調(diào)亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TBI組與TBI+HT組相比，調(diào)亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05)，應(yīng)用亞低溫干預(yù)可以明顯保護(hù)細(xì)胞免受損傷。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)得出以下三個(gè)結(jié)論：（1）外傷后的RIPK-1表達(dá)量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在用于亞低溫這一干預(yù)手段之后可以顯著降低TBI大鼠RIP