亞低溫對(duì)腦外傷后凋亡蛋白MMP-9和TIMP-3表達(dá)影響研究.pdf

1、大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及多數(shù)臨床研究結(jié)果表明亞低溫能減輕創(chuàng)傷性腦損傷后病理?yè)p害的程度，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，但其保護(hù)作用的機(jī)制仍未完全明了。其機(jī)制研究也由生化、代謝水平深入至基因、蛋白水平，人們開(kāi)始從分子水平闡述亞低溫腦保護(hù)的作用機(jī)制。本研究在創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)亞低溫干預(yù)大鼠模型中通過(guò)運(yùn)用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色(DAPI)檢測(cè)海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測(cè)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspa

2、se-3和“失巢”凋亡相關(guān)蛋白MMP-9、TIMP-3表達(dá)變化。試圖證明亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后抑制細(xì)胞凋亡作用是包括針對(duì)“失巢”凋亡在內(nèi)的多機(jī)制、多靶點(diǎn)的保護(hù)措施。 本實(shí)驗(yàn)分為三部分：第一部分：大鼠液壓沖擊腦損傷后亞低溫和常溫模型的建立；第二部分：亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡影響研究；第三部分：亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后“失巢”凋亡相關(guān)蛋白MMP-9、TIMP-3表達(dá)變化研究。 第一部分、大鼠液壓沖擊腦損

3、傷后亞低溫和常溫模型的建立 目的：建立穩(wěn)定的常溫(normothermia)和亞低溫(mild hypothermia)治療液壓沖擊腦損傷(Fluid Percussion Injuri，F(xiàn)PI)動(dòng)物模型。評(píng)估致傷模型的有效性及傷后腦的改變是否符合實(shí)驗(yàn)要求。為深入開(kāi)展創(chuàng)傷性顱腦損傷的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為：假損傷組(n=10)；液壓腦損傷常溫組(n=10)

4、；液壓腦損傷亞低溫組(n=10)。2.液壓腦損傷動(dòng)物模型建立及亞低溫的實(shí)施：亞低溫組大鼠TBI形成后立即予以冰浴降溫，使腦溫在15分鐘內(nèi)下降至32.5±0.5℃，并維持該腦溫水平4h，之后在1h內(nèi)復(fù)溫至正常水平(37±0.3℃)，常溫組大鼠只致傷不降溫，保持腦溫在37±0.3℃，假損傷組大鼠僅做致傷前準(zhǔn)備而不予以液壓打擊。所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在損傷前15分鐘至損傷后4小時(shí)均行各項(xiàng)生理參數(shù)檢測(cè)，每組各4只分別在液壓顱腦傷前后完成神經(jīng)反射時(shí)間評(píng)分

5、測(cè)試，另取每組各3只于傷后24h行組織病理學(xué)分析(H&E染色)。 結(jié)果：所有生理參數(shù)除體溫外均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，而損傷亞低溫組腦溫和肛溫較常溫有明顯差異(P<0.01)。神經(jīng)反射時(shí)間結(jié)果顯示在損傷后常溫組反射時(shí)間明顯增加，而在亞低溫組反射時(shí)間雖然較假損傷組有所增加但是和常溫組相比增加幅度明顯減弱(P<0.01)。組織病理學(xué)分析顯示亞低溫組大鼠致傷灶周圍皮層和海馬腦損傷程度較常溫組大鼠明顯減輕。 結(jié)論：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果顯示該動(dòng)物模型符合臨床上接受亞低溫治療顱腦損傷患者的病理學(xué)改變和病理生理特點(diǎn)。我們成功地建立了大鼠常溫和亞低溫顱腦損傷模型，為下一步亞低溫對(duì)創(chuàng)傷行腦損傷后細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究提供了良好條件。 第二部分、亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷海馬神經(jīng)元凋亡影響的研究 目的：探討亞低溫干預(yù)對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷海馬神經(jīng)元凋亡影響。 方法：前期成功采用側(cè)方液壓沖擊裝置，建立大鼠中度腦損傷亞低溫干預(yù)模型基礎(chǔ)上，SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=5

7、0/組)：假損傷組，損傷常溫組(37±0.3℃)和損傷亞低溫組(32.5±0.5℃)。通過(guò)運(yùn)用DAPI技術(shù)來(lái)分析海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量變化，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot技術(shù)來(lái)檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3在基因和蛋白水平的表達(dá)變化以探討亞低溫干預(yù)TBI對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡影響。 結(jié)果：TBI后24h，DAPI染色結(jié)果顯示損傷常溫組凋亡指數(shù)為32.10％±1.40，而損傷亞低溫組明顯減

8、少僅為18.40％±2.10(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示損傷常溫組Caspase-3表達(dá)分別為210.20％±5.30和170.30％±4.80，而亞低溫干預(yù)組為165.10％±3.70和130.60％±4.10(P<0.01)。TBI后72h，DAPI染色結(jié)果顯示損傷常溫組凋亡指數(shù)為25.50％±1.80，而損傷亞低溫組明顯減少僅為15.50％±2.10(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量RT

9、-PCR和Western-blot結(jié)果顯示損傷常溫組Caspase-3表達(dá)分別為186.20％±6.20和142.30％±5.10，而亞低溫干預(yù)組為152.10％±3.60和120.60％±3.90(P<0.01)。 結(jié)論：創(chuàng)傷性顱腦損傷能夠?qū)е聯(lián)p傷同側(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞和凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3明顯增加，而創(chuàng)傷后即刻開(kāi)始并持續(xù)4小時(shí)的亞低溫干預(yù)治療則能顯著減弱這種上調(diào)作用。 第三部分、亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后“

10、失巢”凋亡相關(guān)蛋白MMP-9、TIMP-3表達(dá)變化研究。 目的：探討亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后“失巢”凋亡相關(guān)蛋白MMP-9、TIMP-3在基因和蛋白水平的表達(dá)變化。 方法：在前期發(fā)現(xiàn)亞低溫能夠明顯抑制TBI損傷同側(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞和凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3的上調(diào)工作基礎(chǔ)上，SD大鼠隨機(jī)分配于假損傷組(n=13)、損傷常溫組(37±0.3℃，n=52)和損傷亞低溫組(32.5±0.5℃，n=52)。損傷組(常溫組

11、和亞低溫組)分6h(n=13)、12h(n=13)、24h(n=13)和72h(n=13)四個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間段檢測(cè)。所有損傷組(常溫組和亞低溫組)每個(gè)時(shí)間段和假損傷組行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot檢測(cè)“失巢”凋亡相關(guān)蛋白MMP-9和TIMP-3分別在基因和蛋白水平的表達(dá)變化(n=5，每組)，并結(jié)合免疫熒光染色檢測(cè)兩者的定位表達(dá)(n=3，每組)。 結(jié)果：損傷同側(cè)海馬MMP-9和TIMP-3的表達(dá)在損傷常溫組較假損傷

12、組明顯增加(p<0.01)，而亞低溫治療能夠明顯抑制這種增加作用。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，亞低溫組MMP-9和TIMP-3在基因水平的高峰表達(dá)分別為常溫組的72.38％±3.51和69.83％±4.33(p<0.01)；在蛋白水平的表達(dá)分別為常溫組的46.03％±1.40和72.83％±5.50(p<0.01)。免疫熒光染色顯示MMP-9和TIMP-3在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。 結(jié)論：證