日本囊對(duì)蝦基因組串聯(lián)重復(fù)序列分析及微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、本文構(gòu)建了日本囊對(duì)蝦隨機(jī)基因組文庫，對(duì)片段長度為400～1000bp的3395個(gè)克隆進(jìn)行測序，在此基礎(chǔ)上分析了微衛(wèi)星和小衛(wèi)星在基因組上的分布特征；利用篩選的含有微衛(wèi)星的克隆序列，設(shè)計(jì)和篩選出了15對(duì)微衛(wèi)星多態(tài)性引物；對(duì)四個(gè)地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，明確了各地理群體的遺傳變異水平和群體間的遺傳分化程度，并對(duì)野生和養(yǎng)殖群體間的遺傳變異進(jìn)行了對(duì)比分析。具體的分析結(jié)果如下：1-基于基因組水平上的串聯(lián)重復(fù)序列特征分析構(gòu)建了日本囊對(duì)蝦隨機(jī)基因

2、組文庫，對(duì)其中片段長度為400～1000bp的3395個(gè)克隆測序，共獲得總長度為1606711bp的DNA序列。序列拼接后的2815個(gè)克隆序列中，找到1206個(gè)微衛(wèi)星序列和487個(gè)小衛(wèi)星序列，其序列總長度分別占測序序列總長度的5.9[％]，和3.79[％]。 微衛(wèi)星序列中，以兩核苷酸重復(fù)的序列數(shù)目最多，約占微衛(wèi)星總數(shù)的69.82％，三核苷酸重復(fù)次之，約占12.35％。兩核苷酸重復(fù)中以AT重復(fù)最為豐富，約占兩核苷酸重復(fù)序列總數(shù)的2

3、9.44％。低拷貝區(qū)間(≤42)的重復(fù)序列的數(shù)量大，約占微衛(wèi)星總數(shù)的72.3l[％]。重復(fù)單位拷貝數(shù)的變異能力分析表明，變異系數(shù)最大的前3種重復(fù)類型，均為4～6核苷酸，重復(fù)單位越長，變異水平越高。重復(fù)單位長度與拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.428)關(guān)系，即重復(fù)單位長度越長，拷貝數(shù)越少。AT含量大于等于50[％]的微衛(wèi)星序列數(shù)目(1127)約占全部微衛(wèi)星序列數(shù)目(1206)的93.45[％]，微衛(wèi)星序列為富含AT序列。兩核苷酸和三核苷酸重復(fù)序

4、列按照AT含量劃分重復(fù)類型，則基序AT含量與對(duì)應(yīng)的重復(fù)序列數(shù)目存在著正相關(guān)，即基序AT含量越高，序列數(shù)目越多。另外，微衛(wèi)星不同長度重復(fù)類型內(nèi)按照GC含量劃分重復(fù)類型時(shí)，當(dāng)各重復(fù)類型基序GC含量在0～70％間時(shí)，兩端側(cè)翼序列GC含量與之存在著正相關(guān)關(guān)系。這可能意味著微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列的堿基組成對(duì)微衛(wèi)星的產(chǎn)生和進(jìn)化有一定的影響。 小衛(wèi)星序列中，以十二核苷酸重復(fù)序列數(shù)量最多，以12 bp重復(fù)單位的序列數(shù)量最多(8.62％)，總體趨勢

5、表現(xiàn)為隨著重復(fù)單位長度的增加，相應(yīng)的重復(fù)序列數(shù)目降低(r=-0.826，P<0.01)。小衛(wèi)星重復(fù)單位拷貝數(shù)分布范圍以8bp重復(fù)拷貝數(shù)范圍最廣(3.1～47.6)，其次是10bp重復(fù)(2.5～44)；再次是12bp重復(fù)(2.2～28)。平均拷貝數(shù)最高的三種重復(fù)類型分別為8bp重復(fù)(13.45),32bp重復(fù)(9.32)和7bp重復(fù)(9.28)。小衛(wèi)星序列中重復(fù)單位的拷貝數(shù)分布范圍2～48,集中分布在2～30,且表現(xiàn)為隨著拷貝數(shù)目的增加,

6、其相應(yīng)的重復(fù)序列數(shù)目數(shù)量遞減的趨勢。小衛(wèi)星序列中,AT含量大于0.5的小衛(wèi)星序列所占的比例為66[％],小衛(wèi)星序列為富含AT序列。小衛(wèi)星AT含量與相應(yīng)的序列數(shù)目間,沒有相關(guān)關(guān)系(r=0.063,P>0.05)。小衛(wèi)星側(cè)翼序列分析表明,隨著小衛(wèi)星GC含量的升高,其兩端側(cè)翼序列GC含量表現(xiàn)為不斷增大的趨勢(r=0.73 1,P<0.01),小衛(wèi)星序列的產(chǎn)生與其兩端側(cè)翼序列的堿基組成存在一定的關(guān)系。 2日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)

7、 根據(jù)建立的日本囊對(duì)蝦部分基因組文庫,篩選其中含有微衛(wèi)星序列的克隆設(shè)計(jì)引物。在2815個(gè)克隆測序序列中,總共找到了453個(gè)包含完整側(cè)翼序列(長度大于50bp)的重復(fù)序列,比例為7.16[％]。候選引物設(shè)計(jì)序列中,以兩核苷酸重復(fù)序列數(shù)目為最多,比率為64.9[％],三核苷酸重復(fù)次之(17.66[％]),然后依次是四核酸(9.71[％])、六核苷酸(7.06[％])和五核苷酸重復(fù)(1.54[％])。設(shè)計(jì)了80對(duì)引物,從中篩選出了15對(duì)微衛(wèi)

8、星多態(tài)性引物,并用這15對(duì)引物日本囊對(duì)蝦廣東汕頭群體48個(gè)個(gè)體進(jìn)行了多態(tài)性檢測。電泳結(jié)果表明顯示15個(gè)位點(diǎn)PIC值的變異范圍0.6506～0.9067,均為多態(tài)位點(diǎn)。15個(gè)引物對(duì)的預(yù)期擴(kuò)增片段長度范圍在200～500bp之間,最適Tm值區(qū)間為51～56℃。。15對(duì)引物對(duì)48個(gè)個(gè)體的PCR擴(kuò)增,總共獲得了135個(gè)等位基因,等位基因數(shù)目的可變范圍4～16。其中兩核苷酸重復(fù)類型所占比例為63.7[％](86),其次是四核苷酸重復(fù)16.29[％

9、],其余的重復(fù)類型所占比例均較小。 3日本囊對(duì)蝦地理群體遺傳多樣性分析 通過多元異俗生長分析的方法,對(duì)福建廈門、廣東汕頭和廣西北海日本囊對(duì)蝦3個(gè)地理群體6個(gè)表型生長性狀的多元異速生長系數(shù)進(jìn)行了比較分析。以群體多元異速生長系數(shù)間夾角為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),采用UPGMA方法構(gòu)建3個(gè)地理群體的系統(tǒng)發(fā)生樹。群體多元異速生長系數(shù)間差異的顯著性檢驗(yàn)通過置換檢驗(yàn)來進(jìn)行。研究結(jié)果表明,1st特征值所詮釋的方差百分比為89.95[％]～97.20[

10、％],表型性狀數(shù)據(jù)與多元異速生長模型能夠很好的擬合。群體多元異速生長系數(shù)間的夾角值表明:BH和XM群體間的夾角值(9.1810°)最大,相似度最低:XM和ST群體間的夾角值(5.2295<'。>)最小，相似度最高。UPGMA聚類分析和置換檢驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)地理群體可以分為兩類：XM和ST群體為一類，群體多元異速生長系數(shù)間的差異不顯著(P=61.28％)；：BH群體單獨(dú)劃為一類，BH群體與XM和ST群體多元異速生長系數(shù)間的差異分別為顯著和極

11、顯著(P=2.34％，P=0.32％)。 對(duì)廣西北海(BH)、福建廈門(XM)、廣東汕頭(ST)和臺(tái)灣海峽(TW)4個(gè)日本囊對(duì)蝦野生地理群體共170個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析。利用6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增，共檢測到85個(gè)等位基因。平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為14.17，平均每個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)為8.64。6個(gè)位點(diǎn)的PIC值在0.65～0.90間，平均PIC值為0.77，均為高度多態(tài)位點(diǎn)。4個(gè)地理群體的平均每個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度以TW群體最高

12、(H<,e>=0.8263)，BH群體雜合度最低(H<,e>=0.7441)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)p值表明，4個(gè)群體大部分位點(diǎn)存在著顯著和極顯著的平衡偏離現(xiàn)象。F數(shù)據(jù)顯示，4個(gè)群體的6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均處于雜合子缺失狀態(tài)。群體間配對(duì)F<,is>值結(jié)果表明，XM、ST和Tw群體間的遺傳分化程度較弱，BH群體與這3個(gè)群體間產(chǎn)生了中等程度的遺傳分化。根據(jù)4個(gè)群體的DA遺傳距離進(jìn)行IJPGMA聚類，XM與ST遺傳距離最小，先

13、聚合在一起，其次是TW，最后是BH。AMOVA分析結(jié)果表明88.2697％的變異存在于群體內(nèi)，組間的變異占8.7698％，各群體間的變異只占總變異的2.9605％。 對(duì)日本囊對(duì)蝦野生群體與養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行微衛(wèi)星分析。共分析了野生和養(yǎng)殖群體93個(gè)體，共檢測到73個(gè)等位基因。6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC值(0.6701-0.8989)均大于標(biāo)準(zhǔn)值0.5，為高度多態(tài)位點(diǎn)。野生群體和養(yǎng)殖群體每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)目分別為11.83和

14、9.83，每個(gè)位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)目分別為8.58和6.86。野生群體和養(yǎng)殖群體的觀察雜合度和期望雜合度分別為0.5055和0.4595，0.8169和0.8209。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)表明，兩個(gè)群體中都有相當(dāng)數(shù)量的位點(diǎn)出現(xiàn)了顯著偏離或者是極顯著偏離。野生群體和養(yǎng)殖群體的等位基因數(shù)目(71，59)差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，二者差異并不顯著(P=0.296)。野生群體和養(yǎng)殖群體觀察雜合度和期望雜合度成對(duì)樣本的t檢驗(yàn)均表