光皮松微衛(wèi)星標記的開發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、光皮樺為我國特有的優(yōu)良用材樹種,系樺木科（Betulaceae）樺木屬（Betula）落葉喬木。光皮樺具有較高的經(jīng)濟價值和廣泛的用途,其材質(zhì)優(yōu)良,木材堅硬,已被國家列入一類材。光皮樺作為一種優(yōu)良的速生闊葉樹種,對于發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟,調(diào)整林分結(jié)構(gòu),改善生態(tài)環(huán)境都有十分重要的意義。本文從光皮樺EST(ExpressedSequenceTags,EST)序列開發(fā)出微衛(wèi)星標記,并應(yīng)用于光皮樺遺傳多樣性分析和遺傳圖譜的構(gòu)建。
　　 光皮樺轉(zhuǎn)錄

2、組隨機測序獲得53799條序列,通過序列前處理和聚類拼接后得到37662條,共計1687.3kb的無冗余Unigene。對處理后的ESTs進行微衛(wèi)星搜索,共搜索到4419個SSRs,分布于3692條ESTs中,平均每3.8kb出現(xiàn)一個SSR位點,SSR出現(xiàn)的頻率是11.73％。五種重復(fù)類型中主要是三核苷酸重復(fù),占所有SSRs的50.03％;但含量最豐富的SSR重復(fù)類型是AG/TC二核苷酸重復(fù)類型,占總SSR位點數(shù)的11.00％,而三核苷

3、酸重復(fù)中出現(xiàn)頻率較高的是CTT/GAA,只占總SSR位點數(shù)的5.45％。本文還依據(jù)搜索出的SSRs設(shè)計了引物,共獲得引物3085對。
　　 采用正交設(shè)計L25(56)優(yōu)化EST-SSRPCR反應(yīng)體系,確定最佳PCR反應(yīng)體系為DNA模板濃度4ng·μL-1,引物濃度0.500μmol·L-1,Mg2+1.25mmol·L-1,dNTPs0.250mmol·L-1,Taq酶0.0725U·μL-1。通過梯度PCR試驗篩選得到相應(yīng)引物

4、的最佳退火溫度。對優(yōu)化出的EST-SSRPCR反應(yīng)體系進行穩(wěn)定性檢測,結(jié)果均能獲得穩(wěn)定、清晰可辨的DNA譜帶。
　　 選擇其中SSR大于16bp的引物308對在公司合成,先用8個無性系個體進行多態(tài)性初篩,260對引物有擴增產(chǎn)物,其中131對具有多態(tài)性。再選擇其中60對高多態(tài)性的EST-SSR引物對光皮樺育種群體77個無性系進行遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示此育種群體內(nèi)的遺傳差異與天然群體相近,同時UPGMA法聚類顯示不同的光皮樺無性系