人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊對膀胱腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：通過應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊干預(yù)膀胱腫瘤細(xì)胞（T24細(xì)胞），探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊對膀胱腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用，并探討其中可能影響到的信號通路。
　　方法：（1）征得參與者書面同意后，獲取人新鮮臍帶，無菌條件下提取剖宮產(chǎn)出生的健康足月新生兒的臍帶和胎盤，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液（含10％胎牛血清）中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合到80-90%時，1:3傳代。采用流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞的表面標(biāo)

2、志，通過檢測抗人CD14,CD31,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,CD105等對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取第3-6代用于實驗。（2）分離、鑒定 hWJMSCs-MVs及蛋白定量分析，取第3-6代 hWJMSCs，采用無血清低糖 DMEM+0.25%BSA（牛血清蛋白）進(jìn)行培養(yǎng)48h后，收集上清培養(yǎng)基。2000g離心30min去除細(xì)胞碎片。100,000g超速離心1h，棄上清，M199重懸，100,000g離

3、心1h，棄上清，M199200μl重懸備用。采用乳膠珠吸附 MVs后流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其膜表面分子（CD9,CD34,CD44,CD45,CD63,CD73）。采用Bradford法進(jìn)行 hWJMSC-MVs蛋白定量。采用透射電鏡負(fù)染法鑒定hWJMSC-MVs。（3）探索 hWJMSC-MVs對膀胱腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控情況及信號通路分析：培養(yǎng) T24細(xì)胞12h后，分別加入100,μg/ml protein hWJMSC-MVs，繼續(xù)培養(yǎng)

4、48h。應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗及Transwell小室法檢測腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。Western Blot檢測E-cadherin，N-cadherin，Snail，MMP2，MMP9,β-catenin，ZEB1，Vimentin表達(dá)水平；（4）應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：（1）采用組織塊貼壁法成功從人臍帶中分離出 hWJMSCs,經(jīng)過1-3次傳代后 hWJMSCs呈貼壁生長，長梭形，形態(tài)均一，增殖旺盛。流式細(xì)胞技術(shù)鑒定

5、顯示hWJMSCs表達(dá) CD44、 CD73、 CD90、 CD105，而不表達(dá) CD14，CD31，CD34，CD45，這些特征符合國際細(xì)胞治療協(xié)會關(guān)于 MSCs的定義。（2）采用高速離心的方法成功地從 hWJMSCs上清液中分離出 MVs，并行透射電鏡及流式細(xì)胞技術(shù)檢測。MVs表面表達(dá) CD9，CD44，CD63，CD73，而不表達(dá)血源性干細(xì)胞分子 CD34，CD45。（3）微囊處理結(jié)果：hWJMSC-MVs處理膀胱腫瘤 T24細(xì)胞

6、后，劃痕實驗及Transwell小室實驗表明實驗組膀胱腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯降低，蛋白定量檢測結(jié)果表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子 E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin、Vimitin、Snail表達(dá)明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊能夠抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；（2）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊能夠抑制膀胱腫瘤細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)化作用，從而影響 T24細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移；（3）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微