NF-κB活化及iNOSmRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)性重癥急性胰腺炎相關(guān)肺損傷中的作用及意義.pdf

1、目的：觀察核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠胰腺和肺組織內(nèi)，尤其是微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況以及誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA在肺組織內(nèi)的表達(dá)情況，探討其在SAP并發(fā)肺損傷中的作用及機(jī)制，并觀察PDTC(二硫代氨基甲酸吡咯烷)對肺損傷的保護(hù)作用。 方法：成年健康SD大鼠45只，雌雄不限，體重250～300g

2、，隨機(jī)分為對照組、SAP組、PDTC預(yù)處理組，每組再分為3h、6h及12h三個時間組。采用5％?；悄懰徕c(sodium taurocholate，Tc-Na)(0.1ml/100g)胰膽管逆行注射誘發(fā)大鼠SAP模型。大鼠術(shù)前12h禁食不禁水，1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)，常規(guī)消毒，上腹部正中切口2cm入腹。加工鈍頭的4＃頭皮針于十二指腸乳頭附近穿刺十二指腸降部外側(cè)壁，自十二指腸乳頭逆行刺入胰膽管末端約1cm，分別在

3、近肝門處及十二指腸乳頭附近用無損傷性小動脈夾夾閉胰膽管兩端，注入5％Tc-Na(注射速度0.1ml/min)，注完后10min拔除針頭，放開動脈夾，逐層關(guān)腹，背部皮下注射生理鹽水約4ml以補(bǔ)充術(shù)中丟失水分。PDTC預(yù)處理組在建立SAP模型前1h腹腔內(nèi)注射NF-κB的特異性抑制劑PDTC(100mg/kg)。對照組處理同SAP組，但胰膽管內(nèi)注射等量生理鹽水。各模型組一次穿刺未成功及術(shù)中死亡者淘汰。開腹觀察胰腺大體變化及腹水情況，開胸觀察肺

4、的大體變化及胸水情況，經(jīng)心臟抽血約3～5ml，提取血清，并用4℃的4％的多聚甲醛行灌注內(nèi)固定，最后分別取胰腺和肺組織，再用4％多聚甲醛浸入固定24h，石蠟包埋、切片。全自動血生化分析儀檢測血清淀粉酶。采用免疫組化SP法觀察NF-kB在胰、肺組織內(nèi)的表達(dá)情況并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。利用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain rea

5、ction，F(xiàn)Q-RT-PCR)法檢測肺組織iNOSmRNA表達(dá)情況，檢測血清淀粉酶濃度，HE染色光鏡觀察胰、肺組織病理學(xué)改變。 結(jié)果： 1.血清淀粉酶濃度測定：SAP各組均明顯高與對照組(P<0.01)，6h達(dá)峰值；PDTC預(yù)處理各組雖明顯高于對照組(P<0.01)，但明顯低于SAP組(P<0.05)。 2.胰、肺肉眼觀察：對照組大鼠胰腺無明顯變化。SAP各組均可見胰腺充血、水腫，局部有散在出血點(diǎn)，局灶性壞死及

6、血性腹水，腸系膜、大網(wǎng)膜上可見皂化斑。PDTC預(yù)處理組腹水和皂化斑明顯減少。對照組大鼠肺肉眼觀察無明顯變化。SAP組均可見肺水腫，表面散在出血點(diǎn)，有少量胸水，局部有小片狀紫褐色肺不張區(qū)，且隨病程進(jìn)展上述表現(xiàn)加重。PDTC預(yù)處理組肺水腫、胸腔積液均明顯減輕。 3.胰、肺組織光鏡觀察：對照組胰腺組織病理改變不明顯。SAP各組胰腺間質(zhì)均可見炎性細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出，且隨病情進(jìn)展程度加重。3h組見胰腺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，腺泡細(xì)胞少量

7、壞死；6h組胰腺間質(zhì)大量紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤，腺泡細(xì)胞廣泛重度腫脹壞死。12h組壞死范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，可達(dá)整個小葉，但小葉輪廓尚見。PDTC預(yù)處理組光鏡下表現(xiàn)與SAP組相似，但炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出減輕。光鏡下對照組肺組織無明顯病理改變。SAP各組肺組織均可見肺間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤，上述改變隨病程進(jìn)展?jié)u加重。此外6h、12h組還可見局灶性或小片狀肺不張(表現(xiàn)為肺泡壁破裂，塌陷實(shí)變)。PDTC預(yù)處理組光鏡下表現(xiàn)與SA

8、P組相似，但上述改變較SAP組減輕。 4.NF-κB在胰、肺組織內(nèi)的表達(dá)：對照組肺組織中僅有少量肺泡間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)NF-κB，SAP組與PDTC預(yù)處理組的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)均明顯表達(dá)NF-κB。SAP 3h組NF-κB陽性信號表達(dá)增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)為58.4±10.808,較對照組明顯增多，隨時程進(jìn)展，NF-κB陽性細(xì)胞增多，強(qiáng)度增加，6h組陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)

9、高峰，其陽性細(xì)胞數(shù)為119.8±17.834，12h組仍保持較高水平，其陽性細(xì)胞數(shù)為90.2±14.361。PDTC預(yù)處理組除3h組外(P>0.05)各時間點(diǎn)NF-κB陽性表達(dá)與SAP組相比均明顯減弱(P<0.05)，但仍明顯高于對照組(P<0.01)。對照組胰腺組織內(nèi)無NF-κB陽性細(xì)胞，在SAP組與PDTC預(yù)處理組胰腺組織內(nèi)NF-κB主要表達(dá)于浸潤的中性粒細(xì)胞及胰腺腺泡細(xì)胞的胞漿和胞核中，其在胰腺組織中的表達(dá)規(guī)律同肺組織。

10、5.iNOSmRNA在肺組織中的表達(dá)情況：對照組肺組織iNOSmRNA呈低水平表達(dá)。SAP組iNOSmRNA表達(dá)明顯上調(diào)。3h表達(dá)較對照組己明顯升高，6h表達(dá)水平最高，12h表達(dá)下降但仍較3h高(P<0.05)。PDTC預(yù)處理組大鼠肺組織iNOSmRNA表達(dá)亦上調(diào)，3h表達(dá)水平明顯上調(diào)，6h達(dá)高峰，12h表達(dá)水平明顯下調(diào)，甚至低于3h(P<0.05)；除3h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)外，各時間點(diǎn)均較SAP組明顯下調(diào)(P<0.05)。

11、 結(jié)論： 1.NF-κB在對照組大鼠胰肺組織內(nèi)不表達(dá)或低水平表達(dá)，而在SAP組大鼠胰肺組織內(nèi)明顯表達(dá)，且隨病程進(jìn)展陽性細(xì)胞數(shù)增多，表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，于6h達(dá)高峰，隨后表達(dá)下降，12h陽性率仍高于3h。提示NF-κB參與了大鼠SAP并發(fā)肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程并呈動態(tài)變化。 2.NF-κB在對照組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)，而在SAP各組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)，提示NF-κB的激活可能是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及微循環(huán)障礙的因素

12、之一。 3.實(shí)時熒光定量PCR顯示，iNOSmRNA在對照組大鼠肺組織內(nèi)呈低水平表達(dá)，而在SAP各組則表達(dá)明顯上調(diào)，且表達(dá)水平有時間依賴性。提示iNOSmRNA的過度表達(dá)可能是SAP肺損傷的原因之一。 4.PDTC預(yù)處理各組大鼠胰、肺組織病理損傷減輕，且NF-κB表達(dá)情況以及肺組織內(nèi)iNOSmRNA表達(dá)較SAP組均有不同程度改善，提示抗氧化劑PDTC可抑制NF-kB激活及iNOSmRNA的表達(dá)，對SAP肺損傷具有保護(hù)作用