多頭帶絳蟲功能基因的原核表達(dá)及蛋白特性分析.pdf

1、多頭帶絳蟲呈世界性分布，成蟲寄生于犬、狼、狐貍等終末宿主的小腸，其中絳期幼蟲——腦多頭蚴寄生于牛、羊等偶蹄動(dòng)物的腦和脊髓等處引起腦多頭蚴病(coenuriasis)。腦多頭蚴病呈世界性分布，常引起患病動(dòng)物發(fā)生死亡，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)人也有感染的報(bào)道。
　　本論文在前人研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)多頭帶絳蟲的密碼子偏好性使用進(jìn)行了分析，并對(duì)GP50等四個(gè)多頭帶絳蟲功能基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和蛋白特性研究，期待為腦多頭蚴病診斷抗原及

2、基因工程疫苗的開(kāi)發(fā)提供候選抗原。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　1、多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好性分析
　　利用多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋的8620個(gè)重構(gòu)基因進(jìn)行了同義密碼子偏好性使用分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組密碼子整體呈弱偏好性，平均GC含量為49.29％，平均GC3含量為51.43％;核酸組成、突變壓力、自然選擇、基因表達(dá)水平、基因所編碼蛋白的總親水性平均系數(shù)、芳香性及氨基酸的選擇等均是影響多頭帶絳蟲密碼子偏好性使用

3、的因素，其中自然選擇可能是影響多頭帶絳蟲密碼子偏好使用的最主要因素;多頭帶絳蟲核糖體基因密碼子的偏好使用主要受到突變的影響，而必需基因密碼子的偏好使用則主要受到選擇的影響;22個(gè)密碼子被確定為最優(yōu)密碼子，推測(cè)基因在進(jìn)化過(guò)程中受到正選擇的影響;最優(yōu)密碼子整體上富含GC堿基(GC∶AU=43∶23)，除CGU外的所有最優(yōu)密碼子都以G/C結(jié)尾。此外，研究發(fā)現(xiàn)多頭帶絳蟲與大腸桿菌、酵母和人均存在不同程度的密碼子偏好性差異，而與豆?fàn)顜Ы{蟲的密碼子

4、偏好性差異較小。本研究對(duì)多頭帶絳蟲密碼子偏好性使用模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析，這能夠?yàn)槎囝^帶絳蟲新基因的發(fā)現(xiàn)、開(kāi)展多頭帶絳蟲分子遺傳工程和進(jìn)化研究提供有價(jià)值的線索。
　　2、多頭帶絳蟲GP50基因的克隆表達(dá)、組織分布及重組抗原間接ELISA診斷方法的建立
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴(kuò)增出GP50基因，結(jié)果顯示GP50基因ORF框?yàn)?97bp，其N-端有48bp的信號(hào)肽序列，除去信號(hào)肽后編碼282個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子大小為

5、31.02 kDa。免疫熒光顯示GP50蛋白主要分布于多頭帶絳蟲成蟲和腦多頭蚴的體表微毛區(qū)及體內(nèi)實(shí)質(zhì)區(qū)，同時(shí)廣泛分布于多頭蚴包囊囊壁;以GP50重組表達(dá)蛋白為抗原建立了檢測(cè)山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法，其敏感性為95％(19/20)、特異性為92.6％(25/27)，與山羊細(xì)頸囊尾蚴血清和綿羊細(xì)粒棘球蚴血清存在交叉反應(yīng)。人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)在感染后的整個(gè)檢測(cè)期（2-17周）GP50抗體值均呈現(xiàn)陽(yáng)性。本研究提

6、示GP50蛋白具有作為山羊腦多頭蚴病診斷抗原的潛在價(jià)值。
　　3、多頭帶絳蟲酸性核糖體磷蛋白P2基因的克隆表達(dá)、組織分布及重組抗原間接ELISA診斷方法的建立
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴(kuò)增出酸性核糖體磷蛋白P2基因(TmP2)。結(jié)果顯示TmP2基因ORF框?yàn)?66bp，編碼121個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白分子大小為13.42kDa，與豬帶絳蟲酸性核糖體磷蛋白P2基因的序列相似性為94％;免疫熒光顯示TmP2蛋白大量分布于

7、多頭帶絳蟲成蟲和腦多頭蚴的實(shí)質(zhì)層，同時(shí)廣泛分布于腦多頭蚴包囊囊壁;以TmP2重組表達(dá)蛋白為抗原建立了檢測(cè)山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法，其敏感性達(dá)95.0％(19/20)、特異性達(dá)96.3％(26/27)，與山羊細(xì)頸囊尾蚴陽(yáng)性血清存在交叉反應(yīng);人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)在感染后的3-10、15-17周呈現(xiàn)血清抗體陽(yáng)性。本研究提示TmP2蛋白具有作為診斷抗原的潛在價(jià)值。
　　4、多頭帶絳蟲脫氧尿苷焦磷酸酶基因的

8、克隆、表達(dá)及其重組蛋白的酶學(xué)活性分析
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴(kuò)增出脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因。結(jié)果顯示多頭帶絳蟲dUTPase基因ORF框?yàn)?47 bp，編碼148個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子大小為16.39 kDa，與豬囊尾蚴、豆?fàn)钅椅豺蔰UTPase基因氨基酸序列相似性分別為100％和96％。SDS-PAGE分析顯示與目的蛋白大小相符的特異條帶，純化后dUTPase蛋白的含量為0.907mg/mL。免疫熒光

9、組化染色顯示dUTPase蛋白主要分布于多頭帶絳蟲成蟲的體內(nèi)實(shí)質(zhì)區(qū)，體表微毛區(qū)有少量分布，同時(shí)廣泛分布于多頭蚴頭節(jié)和包囊囊壁外層。酶學(xué)活性試驗(yàn)證實(shí)重組dUTPase能特異性降解dUTP，酶的比活力為986.29U.mg-1，EDTA能夠抑制dUTPase的活性，而Mg2+能夠增強(qiáng)腦多頭蚴dUTPase的活性。本研究對(duì)多頭帶絳蟲dUTPase基因的相關(guān)特性進(jìn)行了初步的研究，為進(jìn)一步研究多頭帶絳蟲dUTPase基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。<

10、br>　　5、多頭帶絳蟲銅、鋅超氧化物歧化酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)活性分析
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴(kuò)增出銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-S OD)基因。結(jié)果顯示多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD基因ORF框?yàn)?59bp，編碼152個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子大小為16.72 kDa，其氨基酸序列與豬帶絳蟲和肥頭絳蟲Cu/Zn-SOD基因的相似性分別為98％和92％。純化后的多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD蛋白濃度為1.587mg/