多頭帶絳蟲功能基因的原核表達及蛋白特性分析.pdf

1、多頭帶絳蟲呈世界性分布，成蟲寄生于犬、狼、狐貍等終末宿主的小腸，其中絳期幼蟲——腦多頭蚴寄生于牛、羊等偶蹄動物的腦和脊髓等處引起腦多頭蚴病(coenuriasis)。腦多頭蚴病呈世界性分布，常引起患病動物發(fā)生死亡，給畜牧業(yè)造成巨大經濟損失，同時人也有感染的報道。
　　本論文在前人研究基礎上，進一步對多頭帶絳蟲的密碼子偏好性使用進行了分析，并對GP50等四個多頭帶絳蟲功能基因進行了克隆、表達和蛋白特性研究，期待為腦多頭蚴病診斷抗原及

2、基因工程疫苗的開發(fā)提供候選抗原。主要研究內容與結果如下:
　　1、多頭帶絳蟲轉錄組密碼子偏好性分析
　　利用多頭帶絳蟲轉錄組數(shù)據庫中已注釋的8620個重構基因進行了同義密碼子偏好性使用分析。結果發(fā)現(xiàn)多頭帶絳蟲轉錄組密碼子整體呈弱偏好性，平均GC含量為49.29％，平均GC3含量為51.43％;核酸組成、突變壓力、自然選擇、基因表達水平、基因所編碼蛋白的總親水性平均系數(shù)、芳香性及氨基酸的選擇等均是影響多頭帶絳蟲密碼子偏好性使用

3、的因素，其中自然選擇可能是影響多頭帶絳蟲密碼子偏好使用的最主要因素;多頭帶絳蟲核糖體基因密碼子的偏好使用主要受到突變的影響，而必需基因密碼子的偏好使用則主要受到選擇的影響;22個密碼子被確定為最優(yōu)密碼子，推測基因在進化過程中受到正選擇的影響;最優(yōu)密碼子整體上富含GC堿基(GC∶AU=43∶23)，除CGU外的所有最優(yōu)密碼子都以G/C結尾。此外，研究發(fā)現(xiàn)多頭帶絳蟲與大腸桿菌、酵母和人均存在不同程度的密碼子偏好性差異，而與豆狀帶絳蟲的密碼子

4、偏好性差異較小。本研究對多頭帶絳蟲密碼子偏好性使用模式進行了系統(tǒng)分析，這能夠為多頭帶絳蟲新基因的發(fā)現(xiàn)、開展多頭帶絳蟲分子遺傳工程和進化研究提供有價值的線索。
　　2、多頭帶絳蟲GP50基因的克隆表達、組織分布及重組抗原間接ELISA診斷方法的建立
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出GP50基因，結果顯示GP50基因ORF框為897bp，其N-端有48bp的信號肽序列，除去信號肽后編碼282個氨基酸，預測的蛋白分子大小為

5、31.02 kDa。免疫熒光顯示GP50蛋白主要分布于多頭帶絳蟲成蟲和腦多頭蚴的體表微毛區(qū)及體內實質區(qū)，同時廣泛分布于多頭蚴包囊囊壁;以GP50重組表達蛋白為抗原建立了檢測山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法，其敏感性為95％(19/20)、特異性為92.6％(25/27)，與山羊細頸囊尾蚴血清和綿羊細粒棘球蚴血清存在交叉反應。人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在感染后的整個檢測期（2-17周）GP50抗體值均呈現(xiàn)陽性。本研究提

6、示GP50蛋白具有作為山羊腦多頭蚴病診斷抗原的潛在價值。
　　3、多頭帶絳蟲酸性核糖體磷蛋白P2基因的克隆表達、組織分布及重組抗原間接ELISA診斷方法的建立
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出酸性核糖體磷蛋白P2基因(TmP2)。結果顯示TmP2基因ORF框為366bp，編碼121個氨基酸，預測其蛋白分子大小為13.42kDa，與豬帶絳蟲酸性核糖體磷蛋白P2基因的序列相似性為94％;免疫熒光顯示TmP2蛋白大量分布于

7、多頭帶絳蟲成蟲和腦多頭蚴的實質層，同時廣泛分布于腦多頭蚴包囊囊壁;以TmP2重組表達蛋白為抗原建立了檢測山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法，其敏感性達95.0％(19/20)、特異性達96.3％(26/27)，與山羊細頸囊尾蚴陽性血清存在交叉反應;人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在感染后的3-10、15-17周呈現(xiàn)血清抗體陽性。本研究提示TmP2蛋白具有作為診斷抗原的潛在價值。
　　4、多頭帶絳蟲脫氧尿苷焦磷酸酶基因的

8、克隆、表達及其重組蛋白的酶學活性分析
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因。結果顯示多頭帶絳蟲dUTPase基因ORF框為447 bp，編碼148個氨基酸，預測的蛋白分子大小為16.39 kDa，與豬囊尾蚴、豆狀囊尾蚴dUTPase基因氨基酸序列相似性分別為100％和96％。SDS-PAGE分析顯示與目的蛋白大小相符的特異條帶，純化后dUTPase蛋白的含量為0.907mg/mL。免疫熒光

9、組化染色顯示dUTPase蛋白主要分布于多頭帶絳蟲成蟲的體內實質區(qū)，體表微毛區(qū)有少量分布，同時廣泛分布于多頭蚴頭節(jié)和包囊囊壁外層。酶學活性試驗證實重組dUTPase能特異性降解dUTP，酶的比活力為986.29U.mg-1，EDTA能夠抑制dUTPase的活性，而Mg2+能夠增強腦多頭蚴dUTPase的活性。本研究對多頭帶絳蟲dUTPase基因的相關特性進行了初步的研究，為進一步研究多頭帶絳蟲dUTPase基因的生物學功能奠定了基礎。<

10、br>　　5、多頭帶絳蟲銅、鋅超氧化物歧化酶基因的克隆、表達及酶學活性分析
　　從多頭帶絳蟲腦多頭蚴cDNA中擴增出銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-S OD)基因。結果顯示多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD基因ORF框為459bp，編碼152個氨基酸，預測的蛋白分子大小為16.72 kDa，其氨基酸序列與豬帶絳蟲和肥頭絳蟲Cu/Zn-SOD基因的相似性分別為98％和92％。純化后的多頭帶絳蟲Cu/Zn-SOD蛋白濃度為1.587mg/