樟樹葉中木脂素提取分離及其生物活性研究.pdf

1、樟樹主要產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)。樟樹枝繁葉茂，樹形優(yōu)美，不僅能吸收硫、氟等有害氣體，還具有防塵、驅(qū)蟲的功效，因此樟樹常被用來美化環(huán)境、凈化空氣。樟樹葉、枝具有散寒、止痛、補(bǔ)火、助陽的功效，除此之外還具有治療各種痛癥的功效。樟樹葉中含有精油、多酚、黃酮、木脂素等天然活性物質(zhì)。目前對(duì)樟葉中的精油、多酚、黃酮類物質(zhì)研究的較多，但是對(duì)樟樹葉中木脂素類物質(zhì)的研究較少，
　　本文是以樟樹葉為原料，優(yōu)化不同提取技術(shù)優(yōu)化樟樹葉中木脂素工藝條件，對(duì)粗

2、提取物進(jìn)行分離純化并利用高效液相法(HPLC)分析分離物質(zhì)的純度，利用對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧離子自由基的清除效果和還原力的測(cè)試判斷木脂素的抗氧化;通過對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、黑曲霉、青霉的抑菌活性判斷木脂素的抑菌效果;以宮頸癌細(xì)胞(HeLa)為研究對(duì)象，通過MTS，F(xiàn)CM，電化學(xué)法考察木脂素的抗癌效果。結(jié)果如下:
　　(1)利用傳統(tǒng)方法—乙醇回流法為基礎(chǔ)方法，它主要是考察單因素乙醇

3、濃度、料液比、回流時(shí)間對(duì)樟樹葉中木脂素得率的影響，在單因素和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化提取工藝，最終得到最佳的工藝水平。最佳水平為:乙醇濃度為100％，料液比為1∶4(g/mL)，回流時(shí)間為2h。
　　(2)利用微波輔助技術(shù)提取樟樹葉中木脂素類物質(zhì)。主要是通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)微波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。得出響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件為:微波時(shí)間5 min、料液比1∶26(g/mL)、乙醇濃度80％、微波溫度60℃。
　　(3)

4、利用超聲波輔助技術(shù)提取樟樹葉木脂素，結(jié)合單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明在料液比1∶22 g/mL、超聲時(shí)間3 min、乙醇濃度60％、提取時(shí)間78 min條件下，木脂素得率最大。
　　(4)利用對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧離子自由基的清除效果和還原力的測(cè)試判斷粗木脂素類物質(zhì)的抗氧化性能。結(jié)果表明:木脂素具有較好的抗氧化活性，在此基礎(chǔ)上對(duì)粗木脂素進(jìn)行分離純化。
　　(5)通過大孔樹脂、硅膠、LH-20、ODS等

5、柱色譜，薄層色譜(TLC)對(duì)樟樹葉中木脂素類物質(zhì)進(jìn)行純化。分別利用紫外分光光度法(UV)、傅里葉紅外色譜(FT-IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)中的氫譜(1H-NMR)，碳譜(13C-NMR)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。根據(jù)紫外區(qū)的最大吸收峰，紅外色譜不同波段的透射峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)，核磁共振中的氫譜及碳譜中的吸收值最終確定樟樹葉中的3種木脂素，分別為松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、松脂素、芝麻素。通過外標(biāo)法采用高效液相法(HPLC)對(duì)分離出的3

6、種物質(zhì)進(jìn)行純度鑒定。
　　(6)本章則通過肉湯稀釋法和紙片法測(cè)定從樟樹葉中分離到的松脂素對(duì)枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑制作用。在此基礎(chǔ)上利用光學(xué)顯微鏡(LM)、掃描電鏡(SEM)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞膜的通透性說明了松脂素抑制枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的機(jī)制。
　　(7)利用MTS法檢測(cè)了不同濃度的松脂素對(duì)宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和人正常上皮細(xì)胞(HUVEC)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)松脂素以濃度-效應(yīng)的關(guān)系抑制HeLa細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)，

7、并且對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50為200μg/mL。利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和Hoechst33258染色技術(shù)檢測(cè)了松脂素處理前后的HeLa細(xì)胞的凋亡情況和周期情況。
　　(8)利用羧基化的碳納米管和金納米粒子溶液對(duì)玻碳電極進(jìn)行修飾從而放大電化學(xué)信號(hào)。通過循環(huán)伏安法考察不同體積比羧基化的碳納米管和金納米粒子溶液對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了碳納米管的體積與金納米粒子溶液的比例。利用循環(huán)伏安法(CV)和交流阻抗譜(EIS)分別對(duì)