HIV感染者slanDC介導(dǎo)ADCC效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是人體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的一種專職抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，能夠誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，并在連接天然免疫和獲得性免疫中有重要的作用。傳統(tǒng)上，DC主要分為類漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，PDC)和髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cell，MDC)兩個(gè)亞群。slanDC(6-sul

2、fo LacNAc，slan)是DC的新亞群，在抗感染和抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道，在清除HIV儲(chǔ)存庫的研究中，TLR7/8的激動(dòng)劑R848發(fā)揮著一定作用，并作為HIV疫苗的佐劑，發(fā)揮抗病毒作用。研究顯示，正常人slanDC通過表達(dá)的CD16和CD32以及分泌的腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-me

3、diated cytotoxicity，ADCC）效應(yīng)，進(jìn)而將靶細(xì)胞有效的裂解。在被HIV感染的細(xì)胞釋放出新病毒顆粒之前，相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞可以發(fā)揮ADCC效應(yīng)將被感染的細(xì)胞裂解，從而抑制HIV的復(fù)制。HIV感染者體內(nèi)的NK細(xì)胞發(fā)揮的ADCC效應(yīng)與疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，并且可以阻斷HIV在母嬰間的傳播。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，感染HIV18天后，患者體內(nèi)的NK細(xì)胞即可發(fā)揮ADCC效應(yīng)，slanDC作為免疫系統(tǒng)的哨兵，在病原體入侵機(jī)體時(shí)首先發(fā)揮作用

4、，那么HIV感染者的slanDC是否可以發(fā)揮ADCC效應(yīng)以及Toll樣激動(dòng)劑R848對(duì)該效應(yīng)是否有影響，目前尚未見報(bào)道。本課題以HIV感染未接受HAART治療者、接受HAART治療有效者為研究對(duì)象，通過體外構(gòu)建ADCC效應(yīng)模型，檢測HIV感染者slanDC體外發(fā)揮的ADCC效應(yīng)，探討R848對(duì)HIV感染者slanDC體外發(fā)揮ADCC效應(yīng)的影響，進(jìn)一步闡明感染HIV后免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗病毒作用的機(jī)制，為尋找HIV免疫治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

5、r>　　方法：⑴選取HIV感染者共45例，45例HIV感染者均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)確認(rèn)為陽性，根據(jù)是否接受高效抗病毒治療分為未治療組和治療組。健康對(duì)照組(healthy controls，HC)19例，均為HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書，并通過了中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)

6、批準(zhǔn)。⑵用密度梯度離心分離法提取樣本外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并計(jì)數(shù)。取3×106細(xì)胞檢測slanDC表面CD16/CD32，取6×106細(xì)胞檢測slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)。⑶體外ADCC效應(yīng)模型的構(gòu)建。以gp120抗原代替靶細(xì)胞，anti-gp120作為特異性抗體，兩者按比例混合放入37℃孵育1小時(shí)，形成抗原抗體復(fù)合物后，與PMMC共培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，破膜，染slanDC胞內(nèi)分泌的TNF-α，用LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測

7、，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。⑷檢測培養(yǎng)前slanDC表面CD16、CD32。按照BD公司細(xì)胞表面染色說明書操作，用LSRⅡ流式細(xì)胞儀檢測slanDC表面CD16、CD32的表達(dá)。⑸slanDC發(fā)揮ADCC的檢測。共3組分別為實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組，依次加入gp120-anti-gp120復(fù)合物、R848、1640。培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，染slanDC胞內(nèi)分泌的TNF-α，用LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，BD FAC

8、SDivaTM軟件分析結(jié)果。⑹阻斷slanDC表面Fc段受體。在加入抗原抗體復(fù)合物前，加入CD16、CD32的阻斷抗體，混勻后，放入4℃冰箱孵育1小時(shí)。1小時(shí)后，加入gp120-anti-gp120復(fù)合物，混勻后培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，破膜，染slanDC胞內(nèi)TNF-α，多聚甲醛固定后應(yīng)用LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。⑺CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值的檢測。應(yīng)用BD流式熒光抗體，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)

9、胞儀及MultiSET軟件檢測并分析得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值。⑻HIV病毒載量測定。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定病毒載量。⑼統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用SPSS19.0和Graphpad5.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形制作，全部數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，不同組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)正常人slanDC發(fā)揮ADCC效應(yīng)。加入gp120-anti-gp

10、120復(fù)合物后，slanDC分泌的TNF-α顯著高于只加gp120組、anti-gp120組(P＜0.05，P＜0.05)。②HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)。HIV感染未治療者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)顯著低于健康對(duì)照和接受HAART治療者(P=0.0011，P=0.0002);隨治療時(shí)間延長，HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)逐漸恢復(fù)(P=0.0030，P=0.0043，P=0.0095); HIV感染者sla

11、nDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)與其表達(dá)的M-DC8呈負(fù)相關(guān)。③HIV感染者slanDC數(shù)量變化。HIV感染未治療者slanDC的數(shù)量顯著低于健康對(duì)照和接受HAART治療者(P=0.0331，P＜0.0001)，且隨著治療時(shí)間延長，slanDC數(shù)量顯著增加(P=0.0041，P=0.0042，P=0.0009); HIV感染者slanDC數(shù)量與其發(fā)揮的ADCC效應(yīng)呈正相關(guān)(P=0.0018);HIV感染未治療者slanDC數(shù)量與CD4+T細(xì)胞絕

12、對(duì)值呈正相關(guān)(P=0.0178)，與病毒載量呈負(fù)相關(guān)(P=0.0415)。④slanDC通過表達(dá)的CD16/CD32發(fā)揮ADCC效應(yīng)。同時(shí)阻斷CD16、CD32，slanDC分泌的TNF-α顯著降低(P＜0.05)。⑤slanDC表面CD16的表達(dá)。接受HAART治療的HIV感染者slanDC表達(dá)的CD16(MFI)顯著高于HIV感染未治療者和健康對(duì)照(P=0.0014，P=0.0003)，且HIV感染者slanDC表達(dá)的CD16(MF

13、I)與其發(fā)揮的ADCC效應(yīng)正相關(guān)(P＜0.0001);培養(yǎng)6小時(shí)后slanDC表達(dá)的CD16(MFI)顯著降低(P＜0.0001)。⑥slanDC表面CD32的表達(dá)。HIV感染者slanDC表達(dá)的CD32(MFI)與健康對(duì)照無顯著差異，與其發(fā)揮的ADCC效應(yīng)無相關(guān)性，培養(yǎng)前后表達(dá)無變化。⑦R848可恢復(fù)slanDC分泌TNF-α的能力。在R848刺激下，健康對(duì)照者、HIV感染未治療者、HAART治療者的slanDC分泌的TNF-α顯著增

14、高(P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001)，HIV感染未治療者slanDC分泌的TNF-α顯著高于健康對(duì)照者和接受HAART治療者(P=0.0332，P=0.0076)。⑧R848可顯著恢復(fù)HIV感染未治療者slanDC發(fā)揮ADCC的能力。加入R848后，HIV感染未治療者slanDC分泌的TNF-α顯著增加(P=0.0006)。⑨R848不能顯著恢復(fù)HIV感染治療者slanDC發(fā)揮ADCC的能力。加入R848后，HIV

15、感染治療者slanDC分泌的TNF-α無顯著變化(P=0.1649)。⑩HIV感染未治療者slanDC ADCC效應(yīng)的恢復(fù)顯著高于治療者。HIV感染未治療者slanDC的ADCC效應(yīng)的恢復(fù)水平顯著高于接受HAART治療者(P=0.0047)。
　　結(jié)論：⑴HIV感染接受HAART治療者slanDC數(shù)量顯著高于未治療者，隨治療時(shí)間延長，slanDC數(shù)量逐漸恢復(fù)，且HIV感染者slanDC數(shù)量與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)，提示HAART治

16、療有助于HIV感染者slanDC數(shù)量的恢復(fù)。⑵HIV感染未治療者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)顯著低于健康對(duì)照者和接受HAART治療者，但隨治療時(shí)間的延長，slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)逐漸恢復(fù)，提示HAART治療有助于HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)恢復(fù)。⑶HIV感染者slanDC發(fā)揮的ADCC效應(yīng)與其表達(dá)的CD16正相關(guān)，與slanDC數(shù)量正相關(guān)，提示HIV感染者slanDC的數(shù)量及表達(dá)的CD16可影響其發(fā)揮ADCC效應(yīng)。