癲癇患兒血清中HMGB1、IL-2、IL-6水平的變化及其意義.pdf

1、背景與目的：
　　癲癇是大腦神經(jīng)元異常同步放電引起的反復(fù)性、發(fā)作性、暫時(shí)性的慢性腦功能障礙性疾病，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)慢性疾病之一。70％的癲癇病人經(jīng)過(guò)正規(guī)抗癲癇治療后可以完全控制甚至治愈，但是仍有30%病人經(jīng)過(guò)正規(guī)藥物治療后仍反復(fù)發(fā)作而成為難治性癲癇。癲癇的反復(fù)發(fā)作可以導(dǎo)致腦損傷，造成患兒神經(jīng)精神發(fā)育遲滯甚至倒退，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，研究癲癇的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，開(kāi)發(fā)針對(duì)性的藥物，

2、是尋求癲癇新治療方法的途徑。目前從難治性癲癇病人的腦組織病理學(xué)，癲癇動(dòng)物模型的腦組織中以及癲癇病人的腦脊液、血液中均發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作與免疫、炎癥密切相關(guān)，癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致炎性因子釋放，炎性因子又可以降低癲癇發(fā)作的閾值，因此深入研究炎癥因子在癲癇發(fā)生、發(fā)展中的作用，為尋找癲癇治療新的靶點(diǎn)有重要意義。
　　高遷移率族蛋白1（high-mobility-group-box protein1,HMGB1）是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)非組蛋白染

3、色體結(jié)合蛋白，廣泛存在于淋巴組織、腦、肝、心、脾、腎等組織細(xì)胞中，主要存在于胞核。研究顯示巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、垂體細(xì)胞等受內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等誘導(dǎo)后，HMGB1可分泌到細(xì)胞外?？杉せ罴?xì)胞表面的Toll樣受體4（Toll-like receptor4,TLR4），通過(guò)髓樣分化因子88(myeloid differenti

4、ation factor88,MyD88)依賴信號(hào)通道一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致κ基因核結(jié)合因子(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，激活白介素1(Interleukin1，IL-1）、白介素6（Interleukin6，IL-6）、白介素12（Interleukin12，IL-12)、TNF-α、及干擾素-γ（Interferon-γ，INF-γ）等細(xì)胞因子的基因表達(dá)引起炎癥反應(yīng)

5、。研究證實(shí)HMGB1參與了腦缺血、腦損傷、顱內(nèi)感染、敗血癥、胰腺炎、呼吸系統(tǒng)感染等疾病病理過(guò)程，給予 HMGB1抗體可以減輕這些疾病引起的炎癥反應(yīng)，而相反給予重組HMGB1可以加重炎癥反應(yīng)。
　　IL-2是由活化的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是所有T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)活化B細(xì)胞增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子。IL-6也是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo) B細(xì)胞、單核細(xì)胞分化、誘

6、導(dǎo)IL-2和IL-2受體表達(dá)等，在免疫反應(yīng)中也起至關(guān)重要的作用。在遺傳性聲源性癲癇小鼠腦室內(nèi)注射重組IL-2，使得聲音導(dǎo)致癲癇發(fā)作的潛伏期縮短，閾值降低，每次放電和行為發(fā)作的時(shí)間延長(zhǎng)。使用IL-2抗體及其受體的抗體可明顯降低化學(xué)致癇劑和聲音所致癲癇發(fā)作，以上說(shuō)明細(xì)胞因子IL-2、IL-6可能參與了癲癇發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　綜上所述，HMGB1、IL-2、IL-6作為重要的免疫、炎癥因子，在癲癇的發(fā)病過(guò)程有重要作用，但是在兒童癲癇中研

7、究不多，為此本研究對(duì)癲癇兒童近期發(fā)作后血清HMGB1、IL-2、IL-6濃度進(jìn)行檢測(cè)，探討與其臨床發(fā)作的關(guān)系。
　　方法：
　　研究對(duì)象為我院兒科病房2013.11月-2014年8月收住院的6月~12歲癲癇兒童85例。依據(jù)2010年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）及國(guó)際癲癇局（IBE）制定的癲癇發(fā)作和癲癇綜合征診斷指南進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)合臨床表現(xiàn)、既往史及個(gè)人史、家族史、腦電圖及腦MRI而確診為原發(fā)性癲癇；排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、顱腦創(chuàng)傷

8、、腦梗塞、腦出血、腦部占位或遺傳代謝性疾病引起的繼發(fā)性癲癇，并排除服用激素、免疫抑制劑及近期感染者。據(jù)癲癇發(fā)作的頻率及每次持續(xù)時(shí)間進(jìn)行分組，本研究將癲癇發(fā)作每天>3次定義為癲癇頻發(fā)組；發(fā)作持續(xù)30分鐘以上或短期內(nèi)連續(xù)間斷發(fā)作超過(guò)30分鐘，但是間歇期沒(méi)有恢復(fù)到發(fā)作前狀態(tài)者定為癲癇持續(xù)狀態(tài)組。據(jù)此85例癲癇兒童分為癲癇1組（頻發(fā)）20例；癲癇2組（持續(xù)狀態(tài)）16例；癲癇3組（非頻發(fā)或持續(xù)狀態(tài)）49例，男女比例分別為12/8、10/6、29/

9、20。各組病人年齡、性別、病程、發(fā)作類(lèi)型無(wú)明顯差別（P>0.05）。癲癇病人在癲癇發(fā)作后12h內(nèi)采集空腹外周靜脈血2ml，然后室溫下靜置30min，離心20min（離心半徑15cm,3000r/min），留取血清，-80℃冰箱保存。正常對(duì)照組標(biāo)本采集處理同上，批量操作檢測(cè)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清IL-2、IL-6、HMGB-1水平，操作方法嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）

10、；以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程式，計(jì)算待測(cè)樣品濃度，結(jié)果以ng/L或ng/ml表示。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法均應(yīng)用SPSS17.0軟件處理，觀察不同癲癇組之間、癲癇組與正常對(duì)照組之間兒童血清中IL-2、IL-6、HMGB1水平變化及其相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　IL-2在癲癇組中水平明顯高于正常對(duì)照組水平，這種變化同樣見(jiàn)于IL-6、HMGB1中，即癲癇頻發(fā)、癲癇持續(xù)狀態(tài)組、非癲癇頻

11、發(fā)或持續(xù)狀態(tài)組與正常組對(duì)比HMGB1、IL-2、IL-6水平有明顯差異。進(jìn)一步通過(guò)LSD法進(jìn)行多組之間兩兩比較后可見(jiàn)癲癇頻發(fā)組、癲癇持續(xù)狀態(tài)組水平較非癲癇頻發(fā)或癲癇持續(xù)狀態(tài)組IL-2水平高(P<0.05)，且癲癇頻發(fā)組、癲癇持續(xù)狀態(tài)兩組之間 IL-2水平有明顯差異（P<0.05）。癲癇頻發(fā)組、癲癇持續(xù)狀態(tài)組較非癲癇頻發(fā)或癲癇持續(xù)狀態(tài)組中IL-6、HMGB1水平高（P<0.05），但癲癇頻發(fā)組、癲癇持續(xù)狀態(tài)組兩組之間HMGB1、IL-6水

12、平對(duì)比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。另外本實(shí)驗(yàn)中不同癲癇發(fā)作類(lèi)型、有無(wú)應(yīng)用抗癲癇藥物患兒血清中HMGB1、IL-2、IL-6水平無(wú)明顯差異（見(jiàn)表1、表2，P>0.05）。
　　血清中IL-6與HMGB1水平有顯著相關(guān)性，以HMGB1水平為X軸，IL-6水平為Y軸做散點(diǎn)圖分析，可見(jiàn)兩者呈正相關(guān)的線性關(guān)系，進(jìn)一步做Spearman秩相關(guān)分析，兩者相關(guān)系數(shù)r2=0.577，P=0.000。血清中IL-2、HMGB1水平有顯著相關(guān)性，