心肌靶向納米粒的構建及其功能效應的初步評價.pdf

1、研究背景:
　　膿毒癥(sepsis)是由細菌、真菌、病毒等感染因素導致的全身性炎癥反應，起病急驟、病情危重、機制復雜、預后較差是其重要特征，通常會引起全身多臟器功能障礙、衰竭，已成為危重患者的常見死亡原因之一。研究表明，25％以上的膿毒癥患者合并心血管并發(fā)癥，心肌損傷是膿毒癥患者預后不良的重要標志。
　　目前臨床上并無針對性的措施來減輕心肌損傷，因此如何保護心功能，對改善危重患者身體狀況、提高膿毒癥的救治率具有重要意義。N

2、F-κB（nuclear factor-kappa B）是當代研究的熱點，在過度炎癥反應發(fā)生過程中起關鍵性作用。研究證實，膿毒癥發(fā)生時，NF-κB的活性明顯升高，此時應用siRNA(Small interfering Ribonucleic Acid)抑制NF-κB的P65亞基可有效抑制炎癥反應。傳統(tǒng)的給藥方式中siRNA在體內易被降解，納米技術不僅能有效保護siRNA，也能通過化學修飾后獲得主動靶向功能。
　　β1-腎上腺素受體

3、(β1-Adrenergic Receptors，β1-AR)在人體內主要分布在心臟，心肌損傷時，膜表面受體的數(shù)量與敏感性均顯著上調，可作為納米粒的效應靶點。親脂性化合物3-{4-[2-羥基-（1-甲基乙胺基）丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)與β1-AR受體選擇性阻滯劑艾司洛爾(esmolol)具有類似的化學結構，以往的研究表明PAC修飾的脂質體具有較強的心肌細胞特異靶向性。
　　故本課題設想，利用RNA干擾技術以及復合納米材

4、料的靶向性，體外構建β1-AR介導的P65-NF-κB-siRNA心肌細胞靶向納米粒，并通過尾靜脈注射導入小鼠體內，觀察其在小鼠體內的分布情況，建立急性內毒素心肌損傷模型，研究其對心肌細胞的保護作用，從而實現(xiàn)減輕膿毒癥心肌損傷、保護心肌功能、提高膿毒癥救治率的目的。
　　研究方法:
　　1.艾司洛爾類似物PAC的合成
　　通過查閱文獻及總結交流，確定了以3-(4-羥基苯基)丙酸為起始原料，依次經(jīng)過羥基與十六烷醇成酯、環(huán)

5、氧丙基化、異丙胺化等步驟，最后得到終產(chǎn)物PAC的合成路線。
　　2.siRNA的設計合成與篩選
　　針對P65基因，設計合成3種不同的siRNA及陰性對照siRNA，利用lipo2000將siRNA分別轉染到小鼠心肌細胞系(HL-1)細胞內，培養(yǎng)24h后提取RNA行PCR擴增，檢測各組基因表達情況，篩選出干擾效果最好的siRNA。
　　3.納米粒的合成
　　通過查閱文獻和借鑒經(jīng)驗，確定了以siRNA+聚乙二醇(p

6、olyethylene glycol，PEG)為內核、以聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]為納米材料、以維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(Vitamin E-Tocopheryl Polyethylene Glycol1000Succinate，TPGS)為乳化劑的制作方法，優(yōu)化試劑配比及操作步驟，制備心肌靶向納米粒，并利用激光粒徑儀、Zeta電位分析儀、掃描電子顯微鏡等進行各表征分析

7、，通過紫外分光光度計檢測并計算納米粒的包封率、載藥量、釋放率等一系列指標。通過單因素分析優(yōu)化制備工藝，以得到性質最佳的納米粒。
　　4.納米粒的細胞實驗
　　體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞系(HL-1)，熒光顯微鏡檢測細胞表面β1-AR受體表達情況。將各組納米粒加入細胞培養(yǎng)混懸液中，通過熒光顯微鏡和流式細胞學技術檢測細胞對納米粒的攝取及siRNA在細胞內的分布情況。將siNC納米粒和si435納米粒分別轉染細胞，培養(yǎng)24后提取RNA進

8、行PCR擴增，明確基因表達情況。
　　5.納米粒的動物實驗
　　將不同納米粒通過尾靜脈注射到C57BL/6J小鼠體內，24h后小鼠腹腔注射LPS(10mg/Kg)制作膿毒癥損傷模型，小動物成像儀檢測納米粒在體內的分布情況;心尖穿刺取血檢測心肌酶譜、炎癥因子等的變化，取心臟組織行凋亡基因檢測和組織切片染色以明確心肌損傷情況。
　　研究結果:
　　1.合成的艾司洛爾類似物PAC純度高，性質穩(wěn)定，無生物學毒性，可用于進

9、一步的合成研究。
　　2.轉染si435的細胞中mRNA水平表達最低，說明si435對NF-κB的P65亞基抑制作用最強，最終選擇si435作為心肌靶向納米粒的核心。
　　3.經(jīng)過不同配比的合成分析比對，875ul5％PEG+125ul siRNA作為內水相，80mgPLGA+15mg TPGS+5mg PAC溶于8ml丙酮作為有機相，100ml0.03％TPGS作為外水相，按照此配比合成的納米粒粒徑均一，分散性好，電勢分布

10、集中，此時的包封率，載藥量，釋放曲線也比較穩(wěn)定。
　　4.小鼠心肌細胞系(HL-1)細胞膜表面有明顯β1-AR受體表達;不同濃度的空白納米粒與細胞共培養(yǎng)，細胞存活率未受影響，說明納米粒對細胞無毒性;熒光顯微鏡和流式細胞學檢測納米粒在細胞內的分布情況，發(fā)現(xiàn)納米粒分布均勻，細胞攝取率高，能穩(wěn)定進入細胞內部并產(chǎn)生明顯的P65抑制效應。
　　5.心肌靶向納米粒均有較強的心肌細胞靶向性，說明納米粒能靶向識別心肌細胞;小鼠腹腔注射LPS

11、(10mg/Kg)可導致明顯的心肌損傷，而注射si435納米粒組的心肌損傷程度明顯減輕;膿毒癥發(fā)生時，CK、LDH、HBDH均明顯升高，納米粒保護組的表達則顯著降低;炎癥因子、凋亡相關基因的表達情況也有均有同樣的趨勢，說明si435納米粒能有效保護心肌細胞、降低膿毒癥心肌損傷。
　　研究結論:
　　1.成功合成艾司洛爾類似物PAC，純度高，性質穩(wěn)定，無生物學毒性，可用于進一步的合成研究。
　　2.篩選出干擾效果最好的s