抗體靶向多功能金納米粒子的設(shè)計(jì)、合成與生物活性研究.pdf

1、第一章
　　 前言
　　 近年來(lái)，納米技術(shù)迅猛發(fā)展，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用不斷取得突破性進(jìn)展。許多納米平臺(tái)如脂質(zhì)體、聚合物、結(jié)合蛋白、金納米粒子、超順磁性鐵氧化物以及量子點(diǎn)等已經(jīng)被開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于腫瘤的診斷與治療。其中，金納米粒子由于具有較好的生物兼容性、尺寸形狀依賴的光學(xué)與電學(xué)特性以及易于修飾的化學(xué)表面等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，而表現(xiàn)出了能夠向臨床轉(zhuǎn)化的能力。該部分內(nèi)容綜述了金納米粒子的制備、修飾以及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的最新

2、進(jìn)展。
　　 第二章
　　 具有抗體靶向性與細(xì)胞周期調(diào)控功能的金納米粒子增強(qiáng)X-射線對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性
　　 在兒童時(shí)期，成神經(jīng)細(xì)胞瘤是最普遍的顱外實(shí)體瘤。50％以上的病例出現(xiàn)在小于兩歲的兒童群體中?，F(xiàn)有治療手段主要為手術(shù)、化療、放射治療及干細(xì)胞移植。但是，這些治療手段對(duì)于兒童存在明顯的副作用，例如導(dǎo)致生長(zhǎng)延遲、聽(tīng)力喪失及后天學(xué)習(xí)障礙等。盡管能夠進(jìn)行綜合治療，該類腫瘤的復(fù)發(fā)仍然會(huì)奪走許多晚期病人（第四期）的

3、生命。根據(jù)美國(guó)田納西州StJudeChildren'sResearchHospital的臨床統(tǒng)計(jì)，該類病人的五年存活率僅為55％。因而，對(duì)于兒童而言，亟待開(kāi)發(fā)更加高效且腫瘤特異性的治療手段。
　　 GD2神經(jīng)節(jié)苷脂為一類在神經(jīng)外胚層起源的腫瘤（如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素瘤）表面表達(dá)的抗原;在正常組織中，GD2的表達(dá)僅局限于神經(jīng)元、皮膚黑色素細(xì)胞及外周疼痛纖維;這些性質(zhì)使得GD2成為一個(gè)理想的抗體治療靶點(diǎn)。許多抗GD2抗體已經(jīng)被開(kāi)發(fā)并

4、應(yīng)用于臨床，例如3F8、14G2a、ch14.18、hu14.18以及hu14.18K322A等。其中，hu14.18K322A為MerckKGaA公司開(kāi)發(fā)的一個(gè)人源化的抗GD2抗體，在StJudeChildren'sResearchHospital，該抗體正處于免疫治療的一期臨床階段。與hu14.18相比，hu14.18K322A在K322氨基酸進(jìn)行了突變，因而，hu14.18K322A表現(xiàn)出較小的補(bǔ)體激活效應(yīng)，進(jìn)而減少了免疫治療過(guò)程

5、中的副作用（如疼痛、發(fā)燒等癥狀）。本文僅僅利用hu14.18K322A作為金納米粒子識(shí)別成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的靶向分子，并不述及該抗體的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　 許多研究已經(jīng)表明，金納米粒子能夠增強(qiáng)射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，其作用機(jī)理為腫瘤細(xì)胞內(nèi)的金納米粒子能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷。但是，到目前為止，并未見(jiàn)到關(guān)于不同時(shí)期（如G1、S、G2/M）的細(xì)胞與金納米粒子之間相互作用的報(bào)道。在這一領(lǐng)域有大量的工作需要化學(xué)家

6、及生物學(xué)家去完成。另外有研究表明，在細(xì)胞周期的不同階段，細(xì)胞對(duì)射線（X-射線與伽馬射線）的敏感程度并不相同。例如處于S階段的細(xì)胞對(duì)射線有較強(qiáng)的耐受性，而處于G2/M階段的細(xì)胞對(duì)射線則非常敏感。因此，設(shè)計(jì)并合成具有細(xì)胞周期調(diào)控功能的金納米粒子對(duì)于研究不同時(shí)期（如G1、S、G2/M）的細(xì)胞與金納米粒子之間的相互作用以及開(kāi)發(fā)新型且高效的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞特異性的X-射線增敏劑均具有重大意義。
　　 基于以上的理解，本文設(shè)計(jì)、合成了一種具

7、有抗體靶向性與細(xì)胞周期調(diào)控功能的金納米粒子-HPGNP，并對(duì)其生物、化學(xué)行為進(jìn)行了詳細(xì)的研究。
　　 研究目的:合成具有抗體靶向性與細(xì)胞周期調(diào)控功能的金納米粒子-HPGNP;
　　 研究意義:(1)為研究不同時(shí)期（如G1、S、G2/M）的細(xì)胞與金納米粒子之間相互作用提供物質(zhì)基礎(chǔ);(2)開(kāi)發(fā)新型且高效的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞特異性的X-射線增敏劑，降低放射治療的副作用、提高其治療效果。
　　 研究結(jié)果表明:(1)HPGN

8、P可以特異性地識(shí)別成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，這種特異性是通過(guò)hu14.18K322A-GD2的相互作用而實(shí)現(xiàn)的;HPGNP并不能識(shí)別GD2陰性的PC-3細(xì)胞;(2)HPGNP能夠被成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞攝取，并將該類腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M階段（HPGNP并不能識(shí)別GD2陰性的PC-3細(xì)胞，亦不能將其阻滯于G2/M階段;在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)，HPGNP主要存在于內(nèi)吞體、溶酶體及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這對(duì)于研究抗原介導(dǎo)的金納米粒子的內(nèi)吞過(guò)程具有重要的參考價(jià)值）;(3

9、)與HGNP或PTX相比，HPGNP有效地增強(qiáng)了X-射線對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性，同時(shí)降低了X-射線對(duì)GD2陰性細(xì)胞的毒性。細(xì)胞在X-射線條件下的存活率:IMR-32（成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，GD2陽(yáng)性）:82％（HGNP），77％(PTX)，19％（HPGNP）;CHLA-20（成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，GD2陽(yáng)性）:80％(HGNP)，83％(PTX)，18％（HPGNP）;而對(duì)于GD2陰性的PC-3而言:99％（HGNP），63％(PTX)，9

10、7％(HPGNP)。這些研究結(jié)果表明:一方面HPGNP能夠識(shí)別成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞并被其所攝取;在細(xì)胞內(nèi)，被攝取的HPGNP能夠釋放出紫杉醇分子，并將成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期，進(jìn)而增強(qiáng)X-射線對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性;另一方面，HPGNP并不能識(shí)別GD2陰性的PC-3細(xì)胞，同時(shí)也不能進(jìn)入GD2陰性的PC-3細(xì)胞內(nèi)，因而，HPGNP能夠降低X-射線對(duì)GD2陰性細(xì)胞（正常細(xì)胞）的毒性。這些研究結(jié)果對(duì)于開(kāi)發(fā)新型且高效的腫瘤治療手段、增強(qiáng)藥

11、物治療與放射治療的效果以及降低藥物治療與放射治療的副作用有重要的參考價(jià)值。本文的研究亦表現(xiàn)出納米醫(yī)學(xué)在腫瘤治療應(yīng)用中的實(shí)力與靈活性。
　　 第三章
　　 Hu14.18K322A靶向的金納米粒子作為GD2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞分子CT成像的對(duì)比試劑
　　 目前，常規(guī)的CT對(duì)比試劑為含碘的化合物，但這類化合物在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性，例如成像時(shí)間較短(5-10min)、引起腎臟毒性和特異質(zhì)反應(yīng)（如蕁麻診、血管性水腫、喉頭

12、水腫、支氣管痙攣、嚴(yán)重血壓下降及突然死亡等）以及伴隨物理化學(xué)方面的反應(yīng)（如惡心、嘔吐、潮紅、發(fā)熱及局部疼痛等），更為明顯的缺陷是現(xiàn)存的碘類化合物的對(duì)比試劑對(duì)腫瘤細(xì)胞并不具有特異性，同時(shí)亦不是分子CT的對(duì)比試劑。
　　 金納米粒子不僅能很好地吸收X-射線(100keV:gold,5.16cm2g-1;iodine，1.94cm2g-1)，而且其X-射線弱化能力（衰減）大大高于基于含碘化合物的對(duì)比試劑。因此，金納米粒子作為能夠CT成

13、像的對(duì)比試劑;而抗體靶向的金納米粒子將有可能被開(kāi)發(fā)為分子CT成像的對(duì)比試劑。
　　 基于以上的理解，本文合成了hu14.18K322A靶向的金納米粒子-HGNP，并在體外研究了其作為分子CT成像對(duì)比試劑的效果。
　　 研究目的:設(shè)計(jì)、合成能夠作為分子CT成像對(duì)比試劑的金納米粒子-HGNP;
　　 研究意義:(1)開(kāi)發(fā)新型的GD2特異性的分子CT對(duì)比試劑，以提高CT成像在成神經(jīng)細(xì)胞瘤及黑色素瘤診斷中的靈敏度;(2)

14、Hu14.18K322A在StJudeChildren'sResearchHospital正處于一期臨床階段，本文為hu14.18K322A的臨床研究提了供標(biāo)記的手段（金納米粒子作為標(biāo)記的材料）。
　　 研究結(jié)果表明，HGNP特異性識(shí)別GD2陽(yáng)性的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞與黑色素瘤細(xì)胞，并被這些細(xì)胞所攝取。對(duì)于GD2陽(yáng)性細(xì)胞或GD2陰性細(xì)胞，HGNP均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，這表明該納米粒子具有較好的生物兼容性，可以用于鼠模型體內(nèi)分子CT成像

15、的研究。當(dāng)有NK細(xì)胞存在時(shí)，該納米粒子能夠殺死成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。這表明HGNP保留了hu14.18K322A所具有的抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC)的性質(zhì)，即HGNP在體內(nèi)將有可能尋找并殺死GD2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。在合成方面，這一結(jié)果亦間接地證明了hu14.18K322A與GNPs的結(jié)合方式是隨機(jī)結(jié)合而不是定向結(jié)合。在CT條件下，HGNP能夠增強(qiáng)GD2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞與周圍環(huán)境的對(duì)比性。這使得CT能夠檢測(cè)出成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞與黑色素瘤細(xì)胞的分子標(biāo)記