不同功能肽修飾的聚乙烯亞胺衍生物作為基因載體的研究.pdf

1、基因治療的本質(zhì)是用基因載體攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞，通過(guò)遺傳學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常引起的疾病，從而達(dá)到治療各種疾病的目的?；蛑委熥鳛橐环N新的治療手段，可以治療包括癌癥、心血管疾病和遺傳性疾病等多種疾病，目前的研究主要集中于腫瘤的治療。尋找安全高效的基因載體是基因治療的關(guān)鍵之一?；蜉d體分為病毒型基因載體和非病毒型基因載體兩大類(lèi)。非病毒載體通過(guò)理化方法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，具有無(wú)傳染性、化學(xué)結(jié)構(gòu)可控、不限制載體容量及容易于大

2、量制備等特點(diǎn)。與病毒載體相比，它還具有低毒性、低免疫性、所攜帶的目的基因不會(huì)整合至宿主細(xì)胞基因組等優(yōu)勢(shì)。因此，非病毒載體領(lǐng)域近年來(lái)被廣泛研究。聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）因其“質(zhì)子海綿作用”而成為研究最廣泛的一種聚陽(yáng)離子非病毒基因載體。然而PEI在應(yīng)用中存在三個(gè)突出問(wèn)題：第一，聚合物的轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性不一致：即高分子量PEI轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性大；而細(xì)胞毒性小的低分子量PEI，轉(zhuǎn)染效率低。第二，體液穩(wěn)定性與穿

3、膜能力不一致：為了增加PEI體液穩(wěn)定性而增加聚合物的親水性，會(huì)導(dǎo)致PEI的穿膜能力降低，從而不利于目的基因的遞送。第三，PEI的細(xì)胞靶向性差：PEI通過(guò)靜電相互作用與細(xì)胞結(jié)合，因此無(wú)法識(shí)別特定細(xì)胞，靶向性欠缺。
　　普朗尼克(Pluronic)是聚氧乙烯—聚氧丙烯—聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)組成的三嵌段共聚物。具有無(wú)毒、無(wú)刺激、無(wú)免疫原性、可溶于體液等優(yōu)點(diǎn)，是制備聚合物膠束的常用材料之一。普朗尼克內(nèi)部的PEO鏈與PPO鏈的

4、比例可調(diào)，隨著PEO鏈比例增高，該化合物疏水性越弱，反之，則疏水性越強(qiáng)。普朗尼克在水溶液中自發(fā)形成多分子膠束，所形成的膠束尺寸和病毒相仿，適合在體內(nèi)傳輸。
　　整合素是細(xì)胞表面受體的主要家族，是一種介導(dǎo)細(xì)胞和其外環(huán)境之間的跨膜受體。整合素是由α和β兩個(gè)亞單位形成的異二聚體，由它們相互組合形成的整合素有20余種。其中，整合素αvβ3高效表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，而在普通細(xì)胞中罕有表達(dá)，因此，整合素αvβ3已成

5、為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽鏈，能以一定的親和力結(jié)合整合素αvβ3，為腫瘤治療的靶向性提供了新的策略。細(xì)胞穿膜肽可以在不損壞細(xì)胞膜的情況下穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞核。同時(shí)，它還可以介導(dǎo)DNA、多胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。TAT（transactivator，Tat）是編碼HIV復(fù)制和基因表達(dá)所必須的反式激活蛋白，是常見(jiàn)的三種細(xì)胞穿膜肽之一。TAT中49-57位氨基酸殘基arg-

6、lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg（RKKRRQRRR）組成的線性序列可以完全行使細(xì)胞穿膜功能，這是TAT肽既有穿膜特性又無(wú)細(xì)胞毒性的最小片段。大分子物質(zhì)通過(guò)核孔復(fù)合物在細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)主動(dòng)耗能的過(guò)程，直徑小于9 nm的分子或分子量小于60 kDa的蛋白質(zhì)可被動(dòng)彌散通過(guò)核孔復(fù)合物中間通道。非病毒載體轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA，從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)效率較低，是一個(gè)限速過(guò)程。核定位信號(hào)肽NLS富含堿基，結(jié)

7、合DNA形成的DNA-NLS復(fù)合物，在細(xì)胞質(zhì)中可被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識(shí)別，與蛋白質(zhì)結(jié)合后將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)入核。這一特點(diǎn)對(duì)復(fù)合物克服細(xì)胞核膜屏障、提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。擬設(shè)計(jì)三種多肽：（1）特異性親和整合素αvβ3的RGD（R4）；（2）特異性親和整合素αvβ3的RGD肽與核定位信號(hào)肽NLS連接形成的雙功能肽RGD-NLS（R11）；（3）特異性親和整合素αvβ3的RGD肽與細(xì)胞穿膜肽TAT、核定位信號(hào)肽N L S連接形成的三功能肽RGD-TAT-

8、NLS（R18）。通過(guò)與PEI衍生物的連接，考察其作為基因載體修飾物對(duì)基因轉(zhuǎn)染的貢獻(xiàn)。其中，多肽可通過(guò)半胱氨酸（Cys）的巰基與PEI的氨基以SMCC為交聯(lián)劑連接，因此多肽設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)含有半胱氨酸（Cys）。
　　三種功能肽在復(fù)合物入胞過(guò)程中起著不同的作用，將這三種肽以RGD為基礎(chǔ)組合成三種不同的多肽，分別與聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)，形成三種不同的基因載體。通過(guò)比較其理化性質(zhì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，來(lái)評(píng)價(jià)三種不同多肽在基因載體應(yīng)用中的作用。

9、>　　我們對(duì)普朗尼克P123進(jìn)行活化，以其交聯(lián)低分子量PEI（PEI2KDa），得到高分子量聚乙烯亞胺衍生物P123-PEI。同時(shí)分別合成三種多肽R4、R11、R18，將三種多肽分別與PEI衍生物P123-PEI連接，形成三種新型轉(zhuǎn)基因載體 P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18。同時(shí)，比較包括細(xì)胞毒性在內(nèi)的聚合物理化性質(zhì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果，評(píng)價(jià)三種不同多肽在基因載體應(yīng)用中的作用。
　　本文第一章主

10、要介紹了聚乙烯亞胺PEI、普朗尼克及功能肽在基因載體中的應(yīng)用。包括聚乙烯亞胺的特性、普朗尼克P123作為基因載體修飾材料的優(yōu)勢(shì)以及各種功能肽在基因載體應(yīng)用中的研究成果等。
　　本文第二章為三種基因載體 P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的合成和表征。采用固相法制取功能肽，用質(zhì)譜測(cè)定多肽序列，HPLC測(cè)定相對(duì)含量。三光氣和琥珀酰亞胺法活化P123后與PEI2000連接形成 P123-PEI高分

11、子量的聚合物。最后通過(guò)SMCC分別將 R4、R11、R18與P123-PEI偶聯(lián)得到最終產(chǎn)物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18，用1H-NMR表征聚合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，成功合成了功能肽R4、R11、R18，其純度都在95％以上。通過(guò)1H-NMR分析，用SMCC法成功的將R4、R11、R18分別與P123-PEI偶聯(lián)形成最終產(chǎn)物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R

12、18。
　　本文第三章考察了三種聚合物 P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的理化性質(zhì)。將三種聚合物分別與DNA混合后靜置，通過(guò)靜電吸附作用形成一定質(zhì)量比的復(fù)合物。通過(guò)酸堿滴定的方式考察三種復(fù)合物的緩沖能力，使用粒度—電位儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑及Zeta電位，采用掃描電鏡觀察復(fù)合物的表面結(jié)構(gòu)，通過(guò)凝膠電泳考察各復(fù)合物包裹DNA的能力及其對(duì)DNA的保護(hù)能力，最后采用MTT法考察三種聚合物的細(xì)胞毒性。

13、結(jié)果表明，三種聚合物的緩沖能力均明顯好于純水；復(fù)合物呈類(lèi)球形結(jié)構(gòu)，粒徑和電位適中；P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18與DNA質(zhì)量比分別為3.0、0.4和2.0時(shí)可以將DNA完全包裹，此外，三種聚合物都可以保護(hù)DNA抵抗較高濃度的Dnase I及血清的解離。與高分子量PEI（PEI25 KDa）相比，P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18的細(xì)胞活性顯著提高。

14、>　　本文第四章考察了三種復(fù)合物P123-PEI-R4/DNA、P123-PEI-R11/DNA、P123-PEI-R18/DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力。分別以綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pEGFP-N2）和蟲(chóng)熒光素酶質(zhì)粒（pGL3-Control）為報(bào)告基因，考察三種復(fù)合物在B16細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況。分別通過(guò)熒光倒置顯微鏡和生物化學(xué)發(fā)光儀來(lái)評(píng)價(jià)綠色熒光蛋白質(zhì)粒和熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的表達(dá)情況。結(jié)果表明，三種復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率都明顯高于不連接多肽的聚合物P1

15、23-PEI。通過(guò)三種新合成的聚合物與先前課題組成功合成的基因載體P123-PEI-R13相互比較，得出聚合物P123-PEI-R11的轉(zhuǎn)染效果是最好的；修飾基因載體的多肽種類(lèi)不宜過(guò)多，過(guò)多反而影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；在修飾的多肽種類(lèi)適宜的情況下，核信號(hào)定位肽NLS能顯著提高入核的效率。
　　本課題合成了三種的新型的基因載體P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18，并通過(guò)綜合比較得出它們都具有低毒性、高