陽離子型殼聚糖衍生物的設(shè)計(jì)、合成及作為基因載體的應(yīng)用研究.pdf

1、陽離子型非病毒基因載體具有免疫反應(yīng)低、安全性能高、易于合成等特點(diǎn)，成為目前研究的熱點(diǎn)。殼聚糖(CS)是一種天然陽離子聚合物多糖，由于其具有良好的生物安全性、可降解吸收性、組織黏附性、低的基因免疫性、合適的負(fù)載及轉(zhuǎn)染效率，且對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性，作為藥物緩釋和基因載體材料目前已引起廣泛關(guān)注。CS分子鏈中有大量的氨基，通過靜電作用可以與質(zhì)粒DNA(或siRNA)復(fù)合形成CS/DNA復(fù)合粒子，從而有效地保護(hù)DNA不被脫氧核糖核酸酶(DNaseI

2、)酶解，并安全進(jìn)入細(xì)胞。但是高分子量的CS只溶解于稀酸，直接采用CS與DNA復(fù)合時(shí)需在酸性介質(zhì)中進(jìn)行，這對(duì)DNA的活性很木利。而且，CS難溶于一般性的有機(jī)溶劑也給其化學(xué)改性的有效實(shí)施及結(jié)構(gòu)的控制帶來很大困難。因此，尋找合適的途徑使得CS在作為基因載體時(shí)能溶于生理環(huán)境，或者設(shè)計(jì)有效的合成路線對(duì)CS進(jìn)行化學(xué)修飾，使其更好的應(yīng)用于基因的負(fù)載和轉(zhuǎn)染，一直是學(xué)者們努力的方向。除此之外，CS及其衍生物作為基因載體仍然存在轉(zhuǎn)染效率低下等障礙，如何提高

3、它的轉(zhuǎn)染效率也是目前有待解決的一個(gè)難點(diǎn)。 基于以上考慮，本論文從三個(gè)方面對(duì)CS更好地作為藥物或基因載體進(jìn)行了改性及應(yīng)用研究： (1)CS修飾聚乳酸.乙醇酸(PLGA)的陽離子型納米微球。 采用乳化-溶劑揮發(fā)的方法，以不同分子量的CS(M<,w>=9×10<'3>～37.2×10<'4>)作為表面活性劑通過氫鍵作用涂覆在PLGA納米微球表面，制備了可在生理鹽水中與質(zhì)粒DNA復(fù)合的陽離子PLGA/CS納米微球。通過正

4、交試驗(yàn)優(yōu)化了納米微球的工藝參數(shù)，考察了這些參數(shù)如PLGA和CS溶液濃度(C<,PLGA>，C<,CS>)、有機(jī)相/水相體積比(V<,o>'V<,a>)、CS分子量、溶液pH值以及乳化方式對(duì)納米微球粒徑、表面電位及穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，采用本技術(shù)制備粒徑較小而表面電位較高的陽離子型PLGA/CS納米微球的最佳條件為：C<,CS>為3 mg/mL，C<,PLGA>為10 mg/mL，V<,o>'V<,a>為1/4。制備的陽離子型PLGA/

5、CS納米粒子粒徑在150～200 nm范圍內(nèi)，微球形狀規(guī)整，熒光顯微觀察和XPS分析結(jié)果證實(shí)CS包覆于微球表面。在pH=4時(shí)，納米粒子的表面電位達(dá)55 mV，在pH=7時(shí)納米微球表面仍帶正電，當(dāng)pH=8時(shí)，表面電位轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)值。以這種陽離子型PLGA/CS納米微球?yàn)檩d體在生理介質(zhì)中與質(zhì)粒DNA復(fù)合，研究了它的負(fù)載效果和在293FT細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。瓊脂凝膠電泳顯示，當(dāng)PLGA/CS：DNA(w/w)為10：1時(shí)，PLGA/CS能有效地凝聚

6、DNA，PLGA/CS/DNA復(fù)合物對(duì)293FT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高于裸DNA，但低于Lipofectamine2000。因此，這種陽離子型納米微球是一種可在溫和條件下絮凝基因的載體材料。 (2)聚己內(nèi)酯(PCL)接枝修飾CS。 由于CS分子內(nèi)和分子間存在強(qiáng)烈的氫鍵作用，使得它難于溶解于一般的有機(jī)溶劑或去離子水，因此，CS的化學(xué)修飾在實(shí)施及對(duì)最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)控制均存在很大困難。論文以在有機(jī)溶劑中具有良好溶解性能的O-三苯甲基-

7、CS為前驅(qū)體，與含端羧基的PCL-COOH通過NHS/DCC化學(xué)鍵合，在溫和條件和均相體系中發(fā)生接枝反應(yīng)。控制CS和PCL的摩爾投料比以及PCL分子鏈的長度，得到了系列不同CS取代度(ds)和不同側(cè)鏈長度(M<,n>=1200～11000)的新型兩親梳狀接枝共聚物CS-g-PCL。 采用<'1>H NMR、<'13>C NMR、IR、元素分析及GPC對(duì)反應(yīng)過程中的中間產(chǎn)物及最終接枝共聚物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證，<'1>H NMR計(jì)算10

8、0個(gè)糖單元中CS的ds在0.28～0.49范圍內(nèi)。DSC結(jié)果顯示，CS-g-PCL中PCL鏈段的熔融峰溫(Tm)和熔融熱焓(ΔH)均隨著ds的增大和PCL鏈段的長度增加而增大，但都低于PCL均聚物；而且共聚物CS-g-PCL的DSC曲線存在兩個(gè)熔融峰。說明接枝共聚物中PCL鏈段的結(jié)晶行為在一定程度上受到CS主鏈的干擾，導(dǎo)致PCL結(jié)晶相不完善。 X-衍射進(jìn)一步證明，CS接枝PCL后，CS的結(jié)晶相被完全摧毀，新的PCL結(jié)晶區(qū)域出現(xiàn)，相應(yīng)結(jié)晶

9、峰的強(qiáng)度隨ds升高而增大。與文獻(xiàn)所報(bào)道的CS接枝聚酯完全不同的是，實(shí)驗(yàn)中所得到的系列CS-g-PCL共聚物溶解性能得到明顯改善。當(dāng)ds較高或PCL鏈段的分子量較大時(shí)，CS-g-PCL共聚物可溶于三氯甲烷；而當(dāng)PCL鏈段分子量較低，ds適當(dāng)?shù)墓簿畚锟赏耆苡谒橘|(zhì)；所有的CS-g-PCL共聚物均可通過溶解．水中透析的方法自組裝形成以PCL鏈段為核、CS鏈段為殼、粒徑為100～200 nm的納米膠束。膠束的粒徑隨ds增加、PCL鏈段的分子量

10、增大而增大，與之相反，膠束所帶電位卻降低。這與CS-g-PCL梳狀共聚物在水相中組裝形成多個(gè)疏水微區(qū)，疏水的PCL鏈段相互纏結(jié)，對(duì)CS的正電性產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)有關(guān)。 對(duì)CS-g-PCL共聚物的的生物相容性，以及CS-g-PCL納米膠束對(duì)siRNA的復(fù)合和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，CS-g-PCL納米膠束與羊間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有良好的生物相容性，并可有效地負(fù)載siRNA，對(duì)人成纖維細(xì)胞具有一定的基因轉(zhuǎn)染效率。 上

11、述研究結(jié)果提示，這種主鏈為親水性的CS鏈段、側(cè)鏈為疏水性的。PCL鏈段的新型接枝聚合物，在同時(shí)進(jìn)行藥物負(fù)載(內(nèi)核負(fù)載輸水性藥物)和鏈接靶向配體或凝聚基因(CS外殼)方面具有雙功能潛能，同時(shí)，也可作為一種新型的陽離子型組織工程支架。 (3)聚乙烯亞胺(PEI)修飾CS。 針對(duì)上述CS及其衍生物納米粒子作為基因載體時(shí)存在轉(zhuǎn)染效率低下等問題，論文設(shè)計(jì)以低分子量的PEI600和PEG2000修飾CS，希望獲得一種高的基因轉(zhuǎn)染效率

12、、低的細(xì)胞毒性并具有可降解特性的陽離子型聚合物，利用陽離子聚合物分子本身的正電性直接與基因復(fù)合形成納米粒子，提高它的負(fù)載效率和轉(zhuǎn)染效率。 首先合成出PEI-b-mPEG兩嵌段共聚物，然后采用高碘酸鹽(10<,4><'->)氧化CS形成相鄰的雙醛基，利用PEI-6-mPEG中的氨基與CS分子鏈中的醛基通過亞胺反應(yīng)合成出三元梳狀CS-g-(PEI-b-mPEG)共聚物。由于采用小分子量PE[接枝CS，既避免了高分子量PEI的陽離子毒

13、性，又獲得了高分子量PEI的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)，小分子量的PEI可以隨CS的降解而被代謝。mPEG的引入，對(duì)于提高納米粒子的穩(wěn)定性，屏蔽PEI對(duì)細(xì)胞膜的陽離子毒性也有重要的價(jià)值。 <'1>H NMR、IR結(jié)果確證了不同共聚物的組成和結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，[O<,4><'->在氧化CS形成雙醛的同時(shí)，降低了CS的分子量，PEI-b-mPEG接枝率達(dá)10.4﹪。 通過MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)CS-g-(PEI-b-mPEG)共聚物的細(xì)胞毒性作了評(píng)

14、價(jià)，結(jié)果顯示，與PEI相比，CS-g-(PEI-b-mPEG)的毒性明顯降低，隨著CS-g-(PEI-b-mPEG)濃度增大，共聚物對(duì)細(xì)胞的毒性稍有增大，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PEI。聚合物的濃度為1 mg/mL，細(xì)胞的存活率仍有70﹪，而PEI不到20﹪。 CS-g-(PEI-b-mPEG)具有優(yōu)良的水溶性，在生理?xiàng)l件下通過靜電作用與siRNA組裝形成由陽離子聚合物鏈段和RNA組成的疏水內(nèi)核和PEG鏈段作為外殼的納米膠束。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)顯

15、示，當(dāng)N/P比為15：1時(shí)CS-g-(PEI-b-mPEG)能夠完全復(fù)合siRNA。復(fù)合物粒徑為192±12.9 m，粒徑分布窄。 流式細(xì)胞儀測試結(jié)果顯示CS-g-(PEI-b-mPEG)/siRNA復(fù)合物對(duì)人成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(65.9±5.3﹪)明顯高于裸siRNA(2.0±0.2﹪)及PEI/sirNA(7.9±0.6﹪)，且與市售Lipofectamihe2000相當(dāng)(71.2±5.7﹪)。而毒性卻遠(yuǎn)低于低分子量的PE