戊二醛預(yù)處理對(duì)牙本質(zhì)仿生再礦化影響的研究.pdf

1、背景：
　　牙本質(zhì)齲是口腔臨床的常見病之一。礦化的膠原是牙本質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)單元。牙本質(zhì)齲的發(fā)生，往往是牙本質(zhì)膠原內(nèi)的羥基磷灰石晶體溶解性脫礦與修復(fù)性再礦化交替發(fā)生的過程，同時(shí)伴隨著膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷，脫礦的膠原纖維空間內(nèi)被水分子充盈。牙本質(zhì)齲引起的牙本質(zhì)缺損是不可逆的損傷，若未及早發(fā)現(xiàn)和治療，波及牙髓，引起牙髓炎或根尖周炎，將嚴(yán)重影響患者的咀嚼功能和面部美觀。
　　牙本質(zhì)仿生礦化則是一個(gè)應(yīng)用納米技術(shù)理論來模仿生物礦化過程的概念

2、驗(yàn)證策略，利用滲透入膠原纖維內(nèi)的無定形磷酸鈣相變?yōu)榱u基磷灰石晶體的過程來置換脫礦膠原纖維內(nèi)的水分子，形成與天然牙本質(zhì)在形貌、尺度和等級(jí)結(jié)構(gòu)上相似的無機(jī)-有機(jī)物復(fù)合體。這種模擬生理過程的脫水機(jī)制，除了可以形成膠原纖維內(nèi)的礦物并恢復(fù)其機(jī)械性能，還可以使牙本質(zhì)中的內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和半胱氨酸組織蛋白酶僵化，從而從根本上更好的保護(hù)脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維，同時(shí)達(dá)到組織重建的目的。因此，仿生再礦化是一種很有前景的牙本質(zhì)修復(fù)方法，通過完成

3、脫礦牙本質(zhì)膠原的再礦化，模擬形成與天然牙本質(zhì)相似的形貌、等級(jí)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性能，最大程度的保留及重建牙體組織。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已研究了脫礦牙本質(zhì)的原位仿生再礦化，但存在耗時(shí)較久的問題。因此，探索一種耗時(shí)短、易操作的再礦化技術(shù)以貼近臨床基本需求成為本課題亟待解決的問題。
　　戊二醛(GA)是廣泛應(yīng)用的交聯(lián)劑，研究表明戊二醛分子對(duì)鈣離子具有較強(qiáng)的親和力。戊二醛為五碳雙官能團(tuán)分子，在分子兩端各有一個(gè)醛基，能與膠原纖維表面的氨基酸殘基（Ly

4、s和Hyl基團(tuán)）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)，醛基是羰基的一種特殊表型，通過對(duì)膠原醛基化修飾，誘導(dǎo)羰基于膠原表面，可促進(jìn)礦化的發(fā)生。
　　目的：
　　基于戊二醛分子對(duì)膠原組織的鈣化能力，本實(shí)驗(yàn)旨在研究戊二醛誘導(dǎo)的膠原交聯(lián)反應(yīng)對(duì)牙本質(zhì)仿生再礦化的影響。本研究涉及了無定形磷酸鈣對(duì)牙本質(zhì)的直接修復(fù)作用;利用醛基的誘導(dǎo)鈣化特性，發(fā)展出一種簡單有效的加快牙本質(zhì)礦化的方法;最后從力學(xué)和生物學(xué)性能兩方面對(duì)再礦化的牙本質(zhì)層進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估牙本質(zhì)再修復(fù)的

5、潛能。
　　方法：
　　1.樣本制備。選取近期新鮮拔除的無齲壞第三磨牙，保存在4℃的0.1 wt％麝香草酚溶液中。所收牙齒經(jīng)患者知情同意，并通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核用于實(shí)驗(yàn)。使用前，用高速渦輪機(jī)去凈冠部牙釉質(zhì)，用慢速切割機(jī)(Boeckeler Instruments，Tucson，USA)垂直于牙體長軸切除釉牙骨質(zhì)界以下的牙根部分，形成牙本質(zhì)塊。在蒸餾水冷卻下將牙本質(zhì)塊切成兩種不同三維大小的樣本:牙本質(zhì)片

6、(10.0 mm×8.0 mm×1.0 mm)，共計(jì)126個(gè)樣本;牙本質(zhì)條(10mm×0.8mm×0.8 mm)，共計(jì)72個(gè)樣本。所獲樣本用35％的磷酸酸蝕10秒，牙本質(zhì)脫礦深度達(dá)2～4μm厚，二蒸水沖洗，備用。
　　2.研究戊二醛分子對(duì)牙本質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的影響。通過拉曼光譜儀（Raman Analysis）分析GA與膠原的交聯(lián)反應(yīng)。繼而將GA處理過的樣本（實(shí)驗(yàn)組）與未GA處理（對(duì)照組）應(yīng)用于脫礦牙本質(zhì)的仿生再礦化對(duì)比，通過掃描電子顯

7、微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)、透射電鏡(Transmission ElectronMicroscope，TEM)表征牙本質(zhì)膠原的超微結(jié)構(gòu)及礦化程度。
　　3.以臨床應(yīng)用為導(dǎo)向，將快速修復(fù)的牙本質(zhì)進(jìn)行力學(xué)性能和生物學(xué)性能的檢測(cè)。應(yīng)用納米壓痕儀(Nanoidentation)檢測(cè)再礦化牙本質(zhì)層的機(jī)械性能，酶解實(shí)驗(yàn)(Enzymatic Degradation)檢測(cè)再礦化的膠原，測(cè)試礦化對(duì)生物降

8、解的抵抗作用，評(píng)估礦物對(duì)膠原的保護(hù)能力。
　　結(jié)果：
　　1.拉曼檢測(cè)結(jié)果表明，5％GA與脫礦牙本質(zhì)層反應(yīng)3min就能使膠原發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成更緊密的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)不影響單根膠原的主體構(gòu)架。
　　2.電鏡結(jié)果顯示，GA處理再礦化2d牙本質(zhì)（實(shí)驗(yàn)組），未GA處理礦化7d牙本質(zhì)（對(duì)照組）與天然牙本質(zhì)的形貌結(jié)構(gòu)和礦化結(jié)晶度相似，但GA預(yù)處理后礦化時(shí)間從7d縮短至2d，由此提出戊二醛處理對(duì)牙本質(zhì)仿生再礦化的促進(jìn)作用。

9、
　　3.納米壓痕檢測(cè)發(fā)現(xiàn):GA處理礦化2d（實(shí)驗(yàn)組），未GA處理礦化7d（對(duì)照組）的彈性模量和納米硬度與天然牙本質(zhì)相近。驗(yàn)證GA預(yù)處理是一種加快牙本質(zhì)修復(fù)的潛在有效的方法。
　　4.酶解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):單純交聯(lián)作用是增強(qiáng)酶抵抗能力的一種有效措施，但無論是GA處理礦化2d（實(shí)驗(yàn)組），還是未GA處理礦化7d（對(duì)照組），已礦化膠原均比單純交聯(lián)膠原抵抗酶解能力更強(qiáng)，從而說明礦物對(duì)膠原有力的保護(hù)作用。提示交聯(lián)與礦化聯(lián)合應(yīng)用的可行性。