重組蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶表達條件的優(yōu)化及結(jié)構(gòu)預(yù)測.pdf

1、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHc)是焦磷酸硫胺素依賴型多酶體系，廣泛存在于原核生物和真核生物中。PDHc復(fù)合體催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)被徹底的氧化分解，為生物體的生命活動提供必要的能量。丙酮酸脫氫酶(E1)是催化丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)的第一個酶，其催化的反應(yīng)是整個反應(yīng)過程中唯一的不可逆步驟，其活性一旦受抑制，則有氧代謝受阻，生物體的代謝活動受到影響。鑒于丙酮酸脫氫酶在代謝中的重要作用，研發(fā)以丙酮酸脫氫酶為靶標(biāo)、

2、具有低毒的抑制劑，將會為抑制劑的研究打開一個全新領(lǐng)域。本研究試圖為篩選出以丙酮酸脫氫酶為靶標(biāo)的殺菌劑提供充足的酶制劑。 本課題組在前期工作中已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達了蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶，但表達產(chǎn)物主要以沒有生物活性的包涵體形式存在。本研究通過對宿主菌的表達條件(培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)基的pH值，菌體密度，誘導(dǎo)劑濃度，誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間)進行優(yōu)化進而獲得有生物活性的重組酶。一般的表達條件是使用pH值為7.2的LB培養(yǎng)基，從培養(yǎng)液

3、菌體密度0.6起，在37℃下，使用終濃度1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3小時。在此條件下所表達的可溶目的蛋白為0.945mg/每100mL培養(yǎng)液，活力為0.09U。表達條件進行優(yōu)化后，結(jié)果表明使用pH值6.0-7.5的TB+M9(體積1：1)培養(yǎng)基，從培養(yǎng)液菌體密度4—4.5(0.0600)起，在2 1℃下，使用終濃度0.04mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)8小時可使可溶的蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶在大腸桿菌中表達量達到5.52mg/每100

4、mL培養(yǎng)液，活力為0.272U。前后條件相比，表達條件優(yōu)化后，可溶的目的蛋白含量增長484％，活性提高近200％。通過親和層析，每100mL培養(yǎng)液可獲得0.168mg重組酶。與重組酶在pH7.0緩沖液中的活性相比，重組酶在pH6.6的緩沖液中有125％的相對活性；重組酶的Vmax是16.34 lamol/min，Kin2.14mmol/L。 在獲得重組蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶的基礎(chǔ)上，對同源性進行了分析。NCBI BLAST顯

5、示，與蠟狀芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶有高達99％的同源性，和枯草芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶的同源性也在80％以上。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示α亞基中卷曲占45.45％，折疊占11.23％，β亞基中卷曲占43.87％，折疊占16.56％。對α亞基和β亞基的親/疏水性分析顯示，α亞基是親水性肽鏈，而β亞基是疏水性肽鏈。Motif分析和預(yù)測顯示，蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶可能含有磷酸化位點，豆蔻?；稽c，酰胺化位點和粘多糖結(jié)合位