版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHc)是焦磷酸硫胺素依賴型多酶體系,廣泛存在于原核生物和真核生物中。PDHc復(fù)合體催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA,乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)被徹底的氧化分解,為生物體的生命活動提供必要的能量。丙酮酸脫氫酶(E1)是催化丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)的第一個酶,其催化的反應(yīng)是整個反應(yīng)過程中唯一的不可逆步驟,其活性一旦受抑制,則有氧代謝受阻,生物體的代謝活動受到影響。鑒于丙酮酸脫氫酶在代謝中的重要作用,研發(fā)以丙酮酸脫氫酶為靶標(biāo)、
2、具有低毒的抑制劑,將會為抑制劑的研究打開一個全新領(lǐng)域。本研究試圖為篩選出以丙酮酸脫氫酶為靶標(biāo)的殺菌劑提供充足的酶制劑。 本課題組在前期工作中已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達了蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶,但表達產(chǎn)物主要以沒有生物活性的包涵體形式存在。本研究通過對宿主菌的表達條件(培養(yǎng)基組成,培養(yǎng)基的pH值,菌體密度,誘導(dǎo)劑濃度,誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間)進行優(yōu)化進而獲得有生物活性的重組酶。一般的表達條件是使用pH值為7.2的LB培養(yǎng)基,從培養(yǎng)液
3、菌體密度0.6起,在37℃下,使用終濃度1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3小時。在此條件下所表達的可溶目的蛋白為0.945mg/每100mL培養(yǎng)液,活力為0.09U。表達條件進行優(yōu)化后,結(jié)果表明使用pH值6.0-7.5的TB+M9(體積1:1)培養(yǎng)基,從培養(yǎng)液菌體密度4—4.5(0.0600)起,在2 1℃下,使用終濃度0.04mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)8小時可使可溶的蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶在大腸桿菌中表達量達到5.52mg/每100
4、mL培養(yǎng)液,活力為0.272U。前后條件相比,表達條件優(yōu)化后,可溶的目的蛋白含量增長484%,活性提高近200%。通過親和層析,每100mL培養(yǎng)液可獲得0.168mg重組酶。與重組酶在pH7.0緩沖液中的活性相比,重組酶在pH6.6的緩沖液中有125%的相對活性;重組酶的Vmax是16.34 lamol/min,Kin2.14mmol/L。 在獲得重組蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶的基礎(chǔ)上,對同源性進行了分析。NCBI BLAST顯
5、示,與蠟狀芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶有高達99%的同源性,和枯草芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶的同源性也在80%以上。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示α亞基中卷曲占45.45%,折疊占11.23%,β亞基中卷曲占43.87%,折疊占16.56%。對α亞基和β亞基的親/疏水性分析顯示,α亞基是親水性肽鏈,而β亞基是疏水性肽鏈。Motif分析和預(yù)測顯示,蘇云金芽孢桿菌丙酮酸脫氫酶可能含有磷酸化位點,豆蔻?;稽c,酰胺化位點和粘多糖結(jié)合位
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶A在胃癌中表達及其與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的研究.pdf
- 丙酮酸脫氫酶系測活方法的比較研究與創(chuàng)新.pdf
- 丙酮酸脫氫酶激酶抑制劑的篩選及抗腫瘤作用研究.pdf
- 嗜熱菌Thermus thermophiles HB8丙酮酸脫氫酶的表達及其酶動力學(xué)測定.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌融合蛋白.pdf
- 丙酮酸脫氫酶激酶-1在結(jié)腸癌中的表達及在細胞增殖和化療中的作用.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌普魯蘭酶基因的鑒定.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌耐熱蛋白酶的菌株篩選、發(fā)酵優(yōu)化及酶學(xué)特性的研究.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因的鑒定、克隆與表達.pdf
- 巨大芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究.pdf
- 52300.蘇云金芽孢桿菌wb,7菌株發(fā)酵條件的研究
- 蘇云金芽孢桿菌制劑 - ny 293—95
- 蘇云金芽孢桿菌WB7幾丁質(zhì)酶定點突變研究.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌芽孢萌發(fā)特點及理化因子對芽孢萌發(fā)的影響.pdf
- 重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)角質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌的分離和鑒定研究.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌luxS基因的克隆表達及對植物抗病的影響.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌WB9的研究.pdf
- 蘇云金芽孢桿菌的重要功能基因.pdf
評論
0/150
提交評論