丙酮酸脫氫酶系測(cè)活方法的比較研究與創(chuàng)新.pdf

1、丙酮酸脫氫酶系或丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHc)是催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA代謝過程中起著關(guān)鍵的作用的一種酶系。丙酮酸脫氫酶活性的測(cè)定在丙酮酸脫氫酶系的性質(zhì)、基因克隆、分離、純化、鑒定及相關(guān)研究中都是必不可少的；對(duì)于研究丙酮酸脫氫酶系的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、分離、純化及鑒定具有重要的理論意義；同時(shí)對(duì)于研究與丙酮酸的代謝異常有關(guān)的疾病，以酮酸脫氫酶系為靶標(biāo)的除草劑和殺菌劑的篩選與開發(fā)也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 目前己有報(bào)導(dǎo)的丙酮酸脫氫酶系

2、活性測(cè)定方法幾乎都是二十世紀(jì)五六十年代就發(fā)展起來(lái)的。根據(jù)使用的手段可分為放射性同位素標(biāo)記法和分光光度法。同位素標(biāo)記法主要用于粗酶液，是基于<'14>C丙酮酸經(jīng)過E1(PDH)的催化作用轉(zhuǎn)CO<,2>，可以通過測(cè)定<'14>C標(biāo)記的CO<,2>生成量來(lái)決定E1酶的活性。分光光度法有測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體活性的還原型輔酶Ⅰ法、碘硝基四唑紫法，測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中E1酶活性的2，6-二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法。 同位素標(biāo)記法是采用動(dòng)

3、態(tài)的測(cè)量，沒有分光光度法便利，同時(shí)它還用到一種相對(duì)不穩(wěn)定的放射性物質(zhì)，易造成環(huán)境污染。所以本研究重點(diǎn)放在對(duì)測(cè)定該酶的分光光度法的研究上，通過采用同一種測(cè)活方法測(cè)定不同來(lái)源的丙酮酸脫氫酶的酶活性，或者用不同的測(cè)活方法測(cè)定同一種丙酮酸脫氫酶的酶活性等實(shí)驗(yàn)手段，對(duì)常用的幾種分光光度法的靈敏度，干擾因素等方面進(jìn)行了比較性的研究，同時(shí)也開創(chuàng)性的發(fā)明了一種新的測(cè)活方法。 研究發(fā)現(xiàn)：常用測(cè)定丙酮酸脫氫酶活性的方法中：鐵氰化鉀法的靈敏度極低；2

4、，6-二氯吲哚酚法靈敏度較高，但易受到疏基保護(hù)劑的影響。測(cè)定還原型輔酶Ⅰ(NADH)形成速率的標(biāo)準(zhǔn)分光光度法常被用于純化的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體活性的測(cè)定，這種方法由于易受到丙酮酸脫氫酶復(fù)合體反應(yīng)產(chǎn)物的副反饋抑制而受到限制，且試劑價(jià)格昂貴。1981年Hinman LM等人報(bào)道了一種在粗的均質(zhì)液中測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體活性的分光光度計(jì)法方法，此方法被用于測(cè)定粗的均質(zhì)液和線粒體制備后的丙酮酸脫氫酶酶活性的測(cè)定。經(jīng)過本研究發(fā)現(xiàn)：本應(yīng)該與丙酮酸脫氫

5、酶復(fù)合體中三個(gè)酶的共同產(chǎn)物NADH反應(yīng)的碘硝基四唑紫，不僅能與NADH反應(yīng)，它同時(shí)也能與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中第一個(gè)酶丙酮酸脫氫酶(E1)的產(chǎn)物直接發(fā)生作用；這種方法也易受到疏基保護(hù)劑的影響，所以這種方法測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的可靠性值得進(jìn)一步商榷。 由于現(xiàn)有的方法在測(cè)定丙酮酸脫氫酶系活性時(shí)不同程度的存在著這樣那樣的缺點(diǎn)，所以本研究在對(duì)丙酮酸脫氫酶系的測(cè)活方法系統(tǒng)研究基礎(chǔ)上，建立了一種新的、經(jīng)濟(jì)有效的測(cè)活方法。該方法的原理是基于偶

6、連丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中E1的產(chǎn)物對(duì)噻唑藍(lán)(MTT)的還原，使最大吸收峰從420nm(黃色)左右紅移到570nm(藍(lán)色)左右。噻唑藍(lán)的作用是作為電子受體。結(jié)果顯示：這種方法所用的試劑比較經(jīng)濟(jì)，靈敏度比2，6-DCPIP法和鐵氰化鉀法高，同時(shí)它穩(wěn)定性好，克服了2，6-DCPIP法易受疏基保護(hù)劑影響，不利于測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中E1的活性的缺點(diǎn)，它既適用于純化的PDH也適用于來(lái)自線粒體的提取后的PDH<,C>中的PDH(E1)，也適用于一定