人類精子鞭毛多發(fā)畸形致病基因研究.pdf

1、據(jù)調(diào)查8％育齡男性存在生育障礙，目前全球有至少2，000萬男性不育患者。男性不育的病因是多方面的，其中與遺傳因素相關(guān)的患者不少于15％，包括單基因病和染色體變異。精子活力對男性生育功能至關(guān)重要。WHO調(diào)查資料顯示，81％的男性生育障礙與精子活力有關(guān)，其中大約20％與精子活動力受損有直接關(guān)系。精子活力嚴(yán)重受損臨床上稱之為為嚴(yán)重弱精子癥，更是導(dǎo)致絕對不育癥的常見原因，因此嚴(yán)重弱精子癥的深入研究具有重要的臨床價值和現(xiàn)實意義。目前，基于精子鞭毛

2、形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)，從遺傳學(xué)的角度，探索弱精子癥相關(guān)男性不育的分子病因是生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域新的熱點。
　　嚴(yán)重弱精子癥可繼發(fā)于生殖道感染，氧化應(yīng)激以及化學(xué)物質(zhì)接觸等獲得性因素導(dǎo)致的死精子癥;也可能原發(fā)于患者本身存在的遺傳因素。一般來說，臨床醫(yī)生從前述這兩方面分析精子活力損傷的原因，對于鞭毛多發(fā)性畸形(multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF)引發(fā)的嚴(yán)重弱精子癥，

3、或完全不動精子癥的致病因素，推測與遺傳有關(guān)。迄今未見MMAF患者使配偶自然妊娠的報道，也未見有常規(guī)體外受精-胚胎移植助孕成功的先例，卵胞漿內(nèi)單精子注射是精子鞭毛多發(fā)畸形患者獲得遺傳學(xué)后代唯一且可行的助孕策略，但是MMAF患者攜帶的致病基因可繼續(xù)遺傳給下一代。目前中國男性MMAF相關(guān)不育癥患者的遺傳起源尚不明確，因此，在臨床上對于這部分患者的遺傳學(xué)診斷和遺傳咨詢尚無理論依據(jù)。
　　自2014年MMAF被正式命名以來，令人欣慰的是相關(guān)

4、研究持續(xù)推進(jìn)，并取得一定成果。MMAF患者的臨床特征可概括為:①原發(fā)性不育;②精子活動率極低，或完全不動;③存活率明顯高于活動率;④光鏡下形態(tài)學(xué)評估，以尾部畸形為主，同一個精子的鞭毛可存在幾種畸形，或不同精子的畸形鞭毛具有相似性;⑤透射電鏡觀察到精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)存在異常，主要表現(xiàn)為中央微管和動力蛋白臂缺失，以及纖維鞘組裝紊亂等;⑥目前ICSI是患者獲得自己遺傳學(xué)后代的唯一途徑，而且ICSI助孕可獲得較好的妊娠結(jié)局。法國學(xué)者Ben Khe

5、lifa M等在2014年首次命名MMAF并且報告了20例北非裔MMAF患者，發(fā)現(xiàn)其中7例與DNAH1基因病理性變異相關(guān)，但是在另外的13例MMAF患者中，并未檢測到DNAH1的病理性突變，這提示MMAF存在遺傳異質(zhì)性。2015年，國內(nèi)學(xué)者楊慎敏等研究了漢族男性MMAF患者群體遺傳背景，遺憾的是該團(tuán)隊在入選的MMAF患者中沒有發(fā)現(xiàn)任何可能的致病基因，提示MMAF患者遺傳起源的復(fù)雜性，有待進(jìn)一步深入研究。
　　關(guān)于單基因病致病基因研

6、究，有多個患者的大家系連鎖分析和定位克隆技術(shù)被認(rèn)為是最常用且有效的方法，但是如果同一個家系中患者數(shù)量少，且部分患者外顯不全，甚至不外顯，或者是散發(fā)的單個患者（與遺傳相關(guān)的軀體疾病比較，遺傳因素相關(guān)的不孕不育絕大多數(shù)是散發(fā)病例，家族聚集非常罕見），對于這些情況連鎖分析很受限制。二代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology，NGS)也稱大規(guī)模平行測序或深度測序，為研究單基因病的致病基因提供了新的思

7、路與方法，因其非必需收集大的家系樣本，且可對全基因組或全外顯子組實施無偏倚測序，使得NGS在探尋單基因病的致病基因方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。本研究運(yùn)用二代測序測序技術(shù)篩選MMAF致病基因，進(jìn)一步結(jié)合分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)原理來驗證突變基因的致病性。
　　目的：
　　以MMAF相關(guān)的嚴(yán)重弱精子癥導(dǎo)致的男性不育患者為研究對象，篩選并鑒定與MMAF相關(guān)已知基因的未知變異，或篩選并鑒定導(dǎo)致MMAF的未知致病基因，以期為臨床上MMAF患者的基

8、因診斷和遺傳咨詢提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分:研究對象是10例中國MMAF不育患者。首先，以父母是近親婚配的患者(P1)為切入點，采取人全基因組重測序方法，對獲得數(shù)據(jù)按照單基因病模式行生物信息學(xué)分析，重點關(guān)注有致病可能的純合變異，先分析已知的與人類MMAF相關(guān)的基因;其次，利用Sanger測序驗證NGS結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且在家系內(nèi)行表型與基因型共分離分析;然后，從基因表達(dá)的角度，在mRNA，蛋白水平行RT-PCR，

9、Westem Bolt和免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察實驗，進(jìn)一步驗證突變的致病性。
　　第二部分:研究對象是通過第一部分研究仍未發(fā)現(xiàn)相關(guān)致病基因的剩余6例MMAF不育患者。首先，行全外顯子組測序，在獲得注釋過的數(shù)據(jù)中，重點關(guān)注在睪丸特異表達(dá)的基因，篩選出存在罕見病理性變異可能與MMAF相關(guān)的基因;其次，Sanger測序驗證外顯子組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，并在家系內(nèi)行共分離分析。6例患者中有1例患者(P10)父母為近親婚配，先對P10患者家系

10、所有核心成員行Sanger測序，在陽性結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對存在相同且可能與MMAF相關(guān)基因的家系內(nèi)行變異與表型共分離分析;然后，從基因表達(dá)的角度，在mRNA和蛋白水平進(jìn)一步驗證突變基因的致病性。
　　結(jié)果：
　　第一部分:發(fā)現(xiàn)P1患者的DNAH1基因存在純合移碼突變exon73:c.11726_11727delCT，父母及哥哥均為該突變雜合子攜帶者，在家系內(nèi)存在變異與表型共分離。P2，P3和P4也存在該純合移碼突變，他們的

11、父母均為該突變雜合子攜帶者，表明4例MMAF患者的3個家系內(nèi)存在變異與表型共分離。該移碼突變在MMAF患者群體中的發(fā)生率是40％(4/10)。同時，通過Western Bolt和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)DNAH1蛋白在MMAF患者精子不表達(dá)，正常對照精子標(biāo)本則反之。
　　第二部分:發(fā)現(xiàn)P10患者的CFAP43基因存在純合剪接突變Chr10:105907757CT/C(c.3661-2A＞-)，P5和P6在CFAP43基因存在復(fù)合雜合變異，

12、分別是錯義突變雜合子c.386C＞A p.Ser129Tyr與無義突變雜合子c.2802T＞A p.Cys934*復(fù)合雜合和aCGH檢測到的雜合缺失片段c.3945_443ldel p.Ile1316Leufs*10與錯義突變雜合子c.253C＞T p.Arg85Trp復(fù)合雜合，并且這些變異均遺傳自父母，在3個家系內(nèi)存在變異與表型共分離。同時，通過RT-PCR和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)CFAP43mRNA和CFAP43蛋白在MMAF患者精子明顯

13、低表達(dá)，與正常對照精子標(biāo)本的實驗結(jié)果比較差異明顯。
　　結(jié)論：
　　第一部分:本部分的研究結(jié)果在基因DNAH1發(fā)現(xiàn)了可導(dǎo)致MMAF的一個新的純合移碼突變:exon73:c.11726_11727delCT。該結(jié)果說明了MMAF起源遺傳因素發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，以及DNAH1蛋白在精子運(yùn)動中的重要功能。本研究首次發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中MMAF相關(guān)男性不育癥的遺傳起源，本研究結(jié)果也驗證了MMAF發(fā)病機(jī)制具有常染色體隱性遺傳特征。

14、　　第二部分:本部分研究結(jié)果充分說明CFAP43基因病理性純合或者復(fù)合雜合突變可導(dǎo)致MMAF，進(jìn)而影響精子活力，造成嚴(yán)重弱精子癥相關(guān)的男性不育;同時，也表明CFAP43基因的病理性突變的致病性具有常染色體隱性遺傳特征;再者，本文的研究也進(jìn)一步充實了MMAF發(fā)病具有遺傳異質(zhì)性的內(nèi)容。
　　創(chuàng)新性：
　　1.首次驗證MMAF的發(fā)生機(jī)制具有常染色體隱性遺傳特征，也充分表明MMAF是導(dǎo)致遺傳性嚴(yán)重弱精子癥相關(guān)男性不育的一個重要原因。

15、
　　2.在DNAH1基因新發(fā)現(xiàn)一個移碼突變exon73:c.11726_11727delCT純合子與MMAF相關(guān)，豐富了DNAH1基因突變譜，而且該突變很可能是中國漢族MMAF患者群體中的熱點突變。首次驗證DNAH1基因病理性突變純合子可遺傳自父母，雜合子不致病，純合子致病。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)CFAP43基因突變與MMAF相關(guān)，并驗證了CFAP43基因病理性突變的雜合子不致病，純合子或復(fù)合雜合子致病。
　　4.首次研

16、究并表明，在MMAF患者群體中，選擇性存在DNAH1和CFAP43雙等位基因功能失活變異的占70％，意味著這兩個基因變異很可能是導(dǎo)致MMAF發(fā)生的主要原因。
　　意義：
　　本研究獲得預(yù)期結(jié)果，首次驗證MMAF發(fā)病機(jī)制具有常染色體隱性遺傳特征，在DNAH1基因新發(fā)現(xiàn)一個移碼突變純合子與MMAF相關(guān)，同時新發(fā)現(xiàn)CFAP43雙等位基因變異與MMAF相關(guān)。預(yù)期這些研究成果能夠為開發(fā)MMAF基因診斷試劑盒應(yīng)用臨床提供依據(jù)，為MMAF

17、患者的遺傳咨詢和植入前遺傳學(xué)診斷（Preimplantation genetic diagnosis，PGD）提供依據(jù)，進(jìn)而為避免MMAF患兒的出生提供可行性方案。
　　本研究獲得預(yù)期結(jié)果，意味著二代測序技術(shù)結(jié)合單基因病分析模式探尋男性不育癥的致病基因具有可行性。在精子形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)異常具有相似性的不育患者群體中，利用注釋過的二代測序數(shù)據(jù)，結(jié)合近親婚配家系子代常染色體隱性遺傳病高發(fā)的特點，探尋在睪丸特異表達(dá)基因的罕見變異純合子，這