玉米赤霉烯酮降解酶高效分泌表達及其酶學特性研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮是一類主要由禾谷鐮刀菌產生的具有致癌作用的次級代謝產物，它能污染許多經濟作物并引起全世界的食品和飼料安全問題，從而帶來巨大的經濟損失。如何安全有效的對污染的糧食或飼料進行脫毒處理，一直是一個比較棘手的問題。傳統(tǒng)物理脫毒和化學的脫毒方法操作性較差，容易破壞糧食的營養(yǎng)成分，也容易引入二次污染。生物降解去除毒素具有反應條件溫和、無有害試劑殘留的優(yōu)點，受到人們的青睞。本研究在前人研究的基礎上，以zlhy-6為目標基因，對pAO815

2、和外源基因進行改造和構建，以得到高效分泌玉米赤霉烯酮降解酶的工程菌，并對降解酶的性質進行了研究，得出如下結論:
　　1.ZEN降解酶基因zlhy-6根據(jù)畢赤酵母基因密碼子偏好性優(yōu)化，經優(yōu)化的序列前端引入α信號肽編碼序列后，送公司利用化學方法合成。通過反復酶切酶連的方法，利用畢赤酵母表達載體pAO815構建含不同拷貝zlhy-6的重組表達載體，重組質粒轉入大腸桿菌TOP10，經抗性篩選，對陽性克隆進行酶切鑒定，證明重組質粒構建成功。

3、經過酶切鑒定，得到了重組表達載體pAO815-α-zlhy-6、pAO815-（α-zlhy-6）2、pAO815-(α-zlhy-6)4、pAO815-(α-zlhy-6)6，分別含1、2、4、6個zlhy-6拷貝。
　　2.得到的一系列重組載體線性化后電擊轉化畢赤酵母GS115，經組氨酸缺陷型平板、SDS-PAGE篩選陽性轉化子。并且通過SDS-PAGE比較不同轉化子的蛋白表達情況，對轉化子發(fā)酵液酶活進行比較，以得出ZEN降解

4、酶分泌量最高、酶活力最高的轉化子。不同拷貝轉化子中以pAO815-（α-zlhy-6）4轉化子蛋白分泌量最高，相應具有較高的降解ZEN能力，發(fā)酵液中酶活力達10 U/mL。
　　3.用pAO815-(α-zlhy-6)4轉化子上清液進行酶活性試驗，反應1h，重組酶對水溶液中20μg/mL ZEN的降解率可達到99％以上。
　　4.進一步研究了溫度、pH、金屬離子等對酶活性的影響。明確了該酶的最適反應溫度為37℃，最適反應pH