阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究.pdf

1、阿特拉津是均三氮苯類內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑,廣泛用于玉米、高粱、甘蔗、果園等防除一年生禾本科雜草及闊葉雜草,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用.阿特拉津在全世界大面積推廣應(yīng)用后,其對農(nóng)田及地下水的污染、對后茬作物的藥害、對人類潛在的遺傳毒性等問題日益突出.為了利用安全高效的生物降解技術(shù)控制和消除阿特拉灃在農(nóng)田環(huán)境中的殘留污染,本研究分離、篩選對阿特拉津具有高效降解能力的菌株,研究了降解菌及其降解酶特性,為開發(fā)和應(yīng)用酶制劑提供基礎(chǔ).本研究結(jié)果對控制農(nóng)田污

2、染,促進(jìn)糧食安全生產(chǎn),保障人類身體健康,保護(hù)生態(tài)環(huán)境均具有重要意義.具體研究結(jié)果如下: 應(yīng)用搖瓶馴化培養(yǎng)方法,從河北、山東等地農(nóng)藥廠排污口淤泥中分離得到4株對阿特拉津有降解能力的細(xì)菌;比較菌株對阿特拉津的降解效率,從中篩選出1株高效降解新菌株BZB-1. 運(yùn)用形態(tài)與生理生化特征以及16S rDNA序列分析等方法對菌株BZB-1進(jìn)行鑒定.其形態(tài)及生理生化特征:革蘭氏陰性菌,細(xì)胞呈長桿狀,無芽孢,極生鞭毛,具有運(yùn)動(dòng)性,氧

3、化酶陽性,接觸酶陽性.該菌株為好氧、氧化型(非發(fā)酵型)細(xì)菌,能利用葡萄糖和乙醇,不能利用甲醇和乳酸,可以利用氨態(tài)氮和硝態(tài)氮化合物,NaCl的耐受濃度為0.5～2﹪,生長溫度耐受范圍為4～45℃.精氨酸脫羧酶陰性,鳥氨酸脫羧酶陰性,賴氨酸脫羧酶陰性,枸櫞酸鹽陰性,硝酸鹽還原陰性,尿酶陽性,七葉靈(苷)水解酶陽性,蛋白胨水(靛基質(zhì)試驗(yàn))陰性,O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶(ONPG)陰性,蔗糖水解酶陽性,麥芽糖水解酶陽性,木糖水解酶陽性,

4、葡萄糖水解酶陽性,硫化氫陰性.BZB-1菌株的16S rDNA基因序列與Shbwlla granuli(顆粒申氏桿菌)的同源性達(dá)到99﹪,結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化特性,綜合判定該菌株為Shinella granuli,此屬種類在我國未見報(bào)道. 研究明確了顆粒申氏桿菌Shinella granuli BZB-1菌株生長的基本規(guī)律和基本條件.顆粒申氏桿菌Shinella granuli BZB-1菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長時(shí),

5、0～6h處于延遲生長期,6～20h時(shí)處于對數(shù)生長期,20h以后進(jìn)入穩(wěn)定及衰亡期;菌株BZB-1對溫度的適應(yīng)范圍較廣,在4～45℃的條件下均能生長,最適生長溫度為30℃;菌株適宜的pn值為6～9之間,最適pH為7;菌株生長對氧的需求量不高,菌體有高濃度發(fā)酵生產(chǎn)的潛力. 通過研究還明確了環(huán)境因子對BZB-1菌株降解效率的影響.利用氣相色譜監(jiān)測底物(阿特拉津)變化量,阿特拉津底物濃度對降解率有顯著影響,當(dāng)阿特拉津濃度較低時(shí)(200m

6、g/L),菌株BZB-1在3天內(nèi)即可將其完全降解(未檢出,檢測限為0.01ng/μ1),隨阿特拉津濃度升高,其完全降解的時(shí)間也相應(yīng)明顯延長.接菌量對降解效率有顯著影響,隨著培養(yǎng)基中接種的菌體濃度的提高,阿特拉津的降解率也逐漸增加,在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,當(dāng)接菌濃度從2.56×10<'6>fu/ml增加到3.28×10<'8>cfu/ml時(shí),其相應(yīng)的降解率從54.0﹪提高到99.7﹪.pH值對降解率有顯著影響,當(dāng)pH值為6～7時(shí),菌株的降解

7、效率較高(96.1～100﹪),pH值大于7時(shí)或pH值小于6時(shí),降解率明顯降低(pH值為8時(shí),降解效率為54.0﹪;pH值為5時(shí),降解率為79.7﹪),降解最適pH為7.溫度對降解率的影響明顯,菌株降解的最適溫度為20～35℃,其降解率均大于98.3﹪,當(dāng)溫度小于20℃(88.8﹪)或高于35℃時(shí)(89.1﹪),菌株的降解力均開始明顯下降. 為了明確菌株降解酶的利用價(jià)值,本文研究了降解酶粗酶液的基本特性.通過酶定位實(shí)驗(yàn),明確了

8、該菌株的阿特拉津降解酶位于細(xì)胞內(nèi),粗酶液與阿特拉津(底物濃度50mg/L,pH7.0,磷酸緩沖液體系3ml,溫度30℃)作用2h,其對底物的去除率可達(dá)到99.0﹪.結(jié)果表明,菌株:BZB-1分泌的降解酶為組成型酶,在無底物誘導(dǎo)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)8代后,該菌對阿特拉津的降解能力仍保持在較高水平,底物誘導(dǎo)前后該菌對阿特拉津的降解能力無顯著變化.溫度對粗酶液降解活性的影響明顯,降解酶適宜的溫度為25～35~C,35℃時(shí)粗酶液對