基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達譜分析平臺的構(gòu)建、優(yōu)化及應(yīng)用.pdf

1、多重基因表達分析是從轉(zhuǎn)錄水平上篩選、明確功能基因的有效方式。目前,表達分析技術(shù)包括高通量、低準確率的cDNA芯片與高精度、低通量的real-time qPCR技術(shù),尚缺乏中等通量(10~30)、較高精度的表達監(jiān)控體系。
　　本文建立并優(yōu)化了一種基于熒光通用引物的中等通量多重定量RT-PCR技術(shù)。該技術(shù)采用了嵌合特異引物引導(dǎo)熒光通用引物擴增的方案,前幾個循環(huán)嵌合特異引物使目的基因待擴序列的兩端加上了通用引物序列,在接下來的循環(huán)過程高

2、濃度的通用引物取代了嵌合特異引物完成整個PCR反應(yīng)。從多對嵌合特異引物的PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粚νㄓ靡锏腜CR反應(yīng)大大降低了PCR反應(yīng)的復(fù)雜性,并且所有待擴目的基因片段也在一對通用引物的作用下被等比例的擴增,從而實現(xiàn)多重定量檢測。該技術(shù)實現(xiàn)了經(jīng)濟可靠的中通量基因表達定量研究,彌補了基因表達分析平臺中cDNA芯片定量準確性低和real-time qPCR通量小的缺點,完善了整個基因表達的分析過程。前期的研究通過全基因組掃描和特異區(qū)段同類系分

3、析發(fā)現(xiàn)在小鼠的X染色體上存在一個與小鼠性發(fā)育啟動時間相關(guān)的QTL區(qū)段,本研究以該QTL區(qū)段為例,選擇了11個目的基因進行了技術(shù)構(gòu)建及優(yōu)化,包括以下三方面的內(nèi)容:引物序列設(shè)計、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和多重PCR反應(yīng)系統(tǒng)。引物序列設(shè)計上完成了通用引物和包括看家基因在內(nèi)的14對基因嵌合特異引物的序列設(shè)計;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的研發(fā)過程中,主要考察了下游嵌合特異引物的量,逆轉(zhuǎn)錄延伸時間;多重PCR體系的研發(fā)過程中,主要考察了通用引物與上游嵌合特異引物的用量比

4、,PCR反應(yīng)程序優(yōu)化(Mg2+濃度、退火時間、延伸時間等),降落式(Touchdown,TD)PCR結(jié)合通用引物補加方案和最低模板檢測靈敏度等。實驗結(jié)果表明,該技術(shù)的檢測靈敏度為102拷貝,通用引物與上游嵌合特異引物的比例以1:1為佳,并且驗證了該技術(shù)的重復(fù)性和準確性。降落式(Touchdown)PCR結(jié)合通用引物補加實驗表明,該優(yōu)化步驟可大大改善低豐度表達基因的擴增。通過對2個品系(C3H/HeJ和C57BL/6J)15日齡小鼠的下丘