基于高通量測序和代謝組學(xué)的艱難梭菌感染患者腸道微生態(tài)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 綜合性醫(yī)院艱難梭菌感染流行病學(xué)特征及危險(xiǎn)因素分析
　　艱難梭菌是一種嚴(yán)格厭氧、革蘭陽性芽孢桿菌，屬于條件致病菌。在長期大量應(yīng)用抗生素或者人體免疫力低下、腸道菌群紊亂的情況下艱難梭菌會過度增殖并釋放毒素，引起以腸道病理損傷為主的感染性疾病，即艱難梭菌感染(Clostridium difficile Infection，CDI)。在西方發(fā)達(dá)國家，艱難梭菌已超過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

2、成為院內(nèi)相關(guān)性感染的首要病原菌。高達(dá)20％-30％的抗生素相關(guān)性腹瀉和近乎所有的偽膜性腸炎與之相關(guān)。近年來，隨著艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAPⅠ/027型)的出現(xiàn)，該病的嚴(yán)重病例數(shù)、復(fù)發(fā)率和病死率均明顯增高。鑒于中國人口眾多，抗生素廣泛使用及人口老齡化的形勢，CDI極有可能成為威脅公共健康的流行性疾病之一，應(yīng)加強(qiáng)艱難梭菌感染監(jiān)測。
　　本研究一方面對我國一家綜合性醫(yī)院腹瀉患者進(jìn)行艱難梭菌分離鑒定、毒素分類及MLST分型研究，從來

3、自不同科室的1845例腹瀉患者糞便中分離出產(chǎn)毒艱難梭菌161株;科室間產(chǎn)毒艱難梭菌的分離率存在差異，ICU和老年病科的分離率較高;艱難梭菌A+B+型檢出率為83.2％(134/161)，A-B+型檢出率為16.8％(27/161)，二元毒素檢出率僅為1.9％(3/161);161株產(chǎn)毒艱難梭菌共分出31個ST型，其中ST-220是本研究新發(fā)現(xiàn)的ST型，ST-54、ST-35和ST-37為本研究菌株中的優(yōu)勢型別，ST-54型為23.0％(

4、37/161)， ST-35型為19.3％(31/161)，ST-37型為10.0％(16/161)，未檢測到高產(chǎn)毒株ST-1（027型）和ST-11(078型);不同的ST型別與毒素基因之間、科室間存在相關(guān)性，ST-37型的菌株均為A-B+，占本研究中A-B+菌株的59.3％(16/27)，ST-54是老年病科、感染病科和血液病科的優(yōu)勢型別，但無證據(jù)提示研究期間院內(nèi)發(fā)生CDI暴發(fā)流行。
　　同時，我們還評估了CDI高危人群血液病

5、科患者艱難梭菌的感染率，并結(jié)合病人的住院診療過程，進(jìn)行了危險(xiǎn)因素分析?；熃M和造血干細(xì)胞移植組分別分離到產(chǎn)毒艱難梭菌21株和14株，計(jì)算得到CDI累積發(fā)病率分別為1.89/1000和3.69/1000住院日;依托泊苷、氟喹諾酮類藥物的使用與CDI發(fā)生相關(guān);35株艱難梭菌共分出13個ST型，ST-54和ST-3為本研究菌株中的優(yōu)勢型別，未檢測到高產(chǎn)毒株ST-1（027型）和ST-11（078型）。近80％的CDI發(fā)生于患者造血干細(xì)胞移植后

6、的第1個月，提示廣大醫(yī)護(hù)人員應(yīng)高度警惕CDI的發(fā)生。該研究為合理應(yīng)用抗生素，預(yù)防CDI，提高診療效率并控制CDI的流行提供了參考。
　　第二部分 艱難梭菌感染患者腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究
　　目前能有效治療CDI的藥物是萬古霉素和甲硝唑，但治療后3個月內(nèi)兩者的復(fù)發(fā)率在10％-30％左右。對于復(fù)發(fā)、難治性CDI，經(jīng)常規(guī)治療無效后可以考慮糞便菌群移植治療，以恢復(fù)患者腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少艱難梭菌定植。糞便菌群移植是現(xiàn)今治療復(fù)發(fā)性、難治

7、性CDI最有效的方法之一，治療成功率可達(dá)83％-92％，這提示我們腸道菌群在治療CDI及對預(yù)防其復(fù)發(fā)有重要的作用。然而，糞便菌群移植因可能存在未知風(fēng)險(xiǎn)，缺乏長期有效性和安全性研究、挑戰(zhàn)患者心理承受能力等原因而沒有被廣泛推廣。因此進(jìn)一步明確糞便菌群中治療CDI的關(guān)鍵細(xì)菌種類，提取腸道有益菌群是未來的重要發(fā)展方、向。
　　本研究利用16S rDNA測序法和熒光定量PCR法對15例CDI患者、18例非艱難梭菌感染院內(nèi)腹瀉患者(C.dif

8、ficile-negative nosocomial diarrhea，CDN)和25例健康對照人群的糞便菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面分析以尋找與CDI相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌種類。三組間多樣性參數(shù)比較和基于Spearman距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果都顯示健康對照人群和CDI、CDN患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)CDI患者與產(chǎn)丁酸相關(guān)的厭氧菌比例如毛螺菌科細(xì)菌、瘤胃球菌科細(xì)菌比例顯著降低，與產(chǎn)乳酸相關(guān)的細(xì)菌比例則顯著升高，與產(chǎn)內(nèi)毒素相關(guān)的腸道潛在致病菌

9、如腸桿菌科細(xì)菌比例明顯增加，而具有抗炎作用的柔嫩梭菌類群及其中最具代表性的Faecalibacterium prausnitzii比例顯著減少，這些菌群結(jié)構(gòu)改變可能與增加艱難梭菌定植的易感性有關(guān)。我們的研究結(jié)果可以為以調(diào)節(jié)腸道菌群為治療手段治療CDI提供理論依據(jù)。
　　第三部分 艱難梭菌感染患者糞便上清代謝組學(xué)研究
　　腸道微生態(tài)是人體最為重要的微生態(tài)系統(tǒng)，相當(dāng)于一個重要的代謝“器官”。我們對于CDI患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與

10、代謝如何關(guān)聯(lián)還知之甚少，因此要從代謝水平對艱難梭菌感染與腸道菌群關(guān)系進(jìn)行深入探索。
　　本研究通過超高效液相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)分析方法，對CDI、CDN患者和健康對照人群糞便上清的代謝物質(zhì)進(jìn)行檢測。采用主成分分析、偏最小二乘法判別分析及正交偏最小二乘法判別分析對三組UPLC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝模式分析，結(jié)果顯示CDI、CDN患者和健康對照人群代謝譜有顯著不同。我們鑒定得到20種特征性代謝產(chǎn)物（主要是與膽汁酸代謝、膽紅素代謝、氨基酸代