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文檔簡介
1、L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人和動物不能自身合成的必需氨基酸之一,廣泛應(yīng)用于制藥、食品等多個領(lǐng)域。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌藥物的中間體,以它為載體,可以把抗腫瘤藥物的分子或基團載入腫瘤區(qū),達到既能抑制腫瘤生長又能降低原腫瘤藥物毒性的目的。L-苯丙氨酸還可抑制心肌成纖細胞的增生,為防治高血壓提供新的方法。研究證明L-苯丙氨酸在抗腫瘤、抗癌等方面有顯著作用,具有廣闊的發(fā)展前景。L-苯丙氨酸最主要的用途是作為食品添加劑阿斯巴
2、甜合成的原料。阿斯巴甜是由苯丙氨酸和天門冬氨酸合成的,甜度為蔗糖的200倍,熱量是等量蔗糖的1/200。阿斯巴甜廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。人們食用后,阿斯巴甜由人體的酶分解轉(zhuǎn)化為氨基酸,被人體吸收后,對人體有營養(yǎng)保健功能。另外,人們食用阿斯巴甜,其殘留部分不會轉(zhuǎn)化為乳酸,因此,對人們的牙齒沒有腐蝕作用。對預(yù)防齲齒病,特別是對兒童的健康有益。還有一重要有點,阿斯巴甜適合糖尿病人食用,因它不需胰島素介入分解,不會增加血糖??傊⑺拱吞疬m用
3、于糖尿病、高血壓、心臟病、肥胖癥患者。 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是通過轉(zhuǎn)氨作用合成L-苯丙氨酸,它不但作為工具酶用L-苯丙氨酸的制備,而且本身具有一定的藥用價值,用于治療實驗鼠的某些腫瘤,進行血清L-苯丙氨酸的定量酶法分析,苯丙酮尿癥的診斷和治療時效果明顯。研究表明PAL在抑制某些腫瘤細胞效果顯著。PAL可迅速抑制癌變細胞DNA和蛋白質(zhì)的合成及細胞的分裂和生長,對正常細胞影響不大。機理可能是PAL降解L-苯丙氨酸從而降低腫瘤細胞
4、生長所必需的氨基酸,使腫瘤細胞因“饑餓”而停止生長,達到抑制腫瘤生長的目的?,F(xiàn)臨床上用脂質(zhì)體包被PAL,可提高酶的催化效率,延長半衰期,降低免疫原性,達到更理想的治療效果。 PAL廣泛分布在高等植物、真菌、酵母菌和唯一的原核生物-鏈霉菌中。然而,在動物中尚未發(fā)現(xiàn)有該酶存在。PAL在高等植物內(nèi),是次生代謝的關(guān)鍵酶和限速酶,在植物防御方面起著重要作用。在微生物體內(nèi),PAL使得微生物可以利用L-苯丙氨酸做為唯一碳源。PAL在酵母菌尤其
5、是紅酵母家族含量最為豐富。本文選擇Rhodosporidiumpaludigenum作為研究材料,對其形態(tài)特征、生理生化特征、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(intergenicspacer region,ITS)序列分析,不同物質(zhì)對產(chǎn)PAL的影響以及誘變育種作了研究。并且對菌株JM432產(chǎn)PAL基因的全長cDNA序列進行克隆。在形態(tài)特征和生理生化特征分類的基礎(chǔ)上,通過分子生物學(xué)方法對PAL產(chǎn)生菌JM432進行了分類鑒定。菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征,部分生理
6、生化反應(yīng)研究表明菌株JM432具有紅色酵母的形態(tài)特點,不發(fā)酵任何糖,無合成類淀粉化合物的能力,利用硝酸鉀迅速而強烈。測定和分析了菌株的18S-26S rRNA ITS序列。研究結(jié)果表明,菌株JM432為紅冬孢酵母屬中的Rhodosporidium paludigenum。 通過單因素實驗,研究了L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸,銨根離子,無機鹽,微量元素對PAL活力的影響。結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物對PAL的影響不大,
7、當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為0.1%時,PAL活力僅為對照的123.04%;L-異亮氨酸濃度為0.1%時,PAL的活力為對照的121.25%;L-酪氨酸抑制PAL的合成;無機鹽-鐵離子對PAL有激活作用,酶活力達到對照的192.17%;在培養(yǎng)基中添加0.1%的硫酸銨,PAL活力為對照的258.56%;微量元素-銅離子對PAL的影響最大,酶活力為對照的384.56%。 以JM432作為實驗出發(fā)菌株:制備菌懸液,加入8-MOP(甲氧基補骨質(zhì)
8、素,methoxy-psoralen)黑暗中放置30分鐘。8-MOP是一種光敏試劑,8-MOP與長波紫外線復(fù)合可以產(chǎn)生誘變效應(yīng),常用于治療某些皮膚病。將8-MOP應(yīng)用于PAL的突變株篩選目前尚未有報道。紫外燈下照射誘變,紅光下涂布篩選平板。本研究采用的篩選方法是類似物篩選系統(tǒng)。L-苯丙氨酸是PAL的作用底物,可以誘導(dǎo)酶的合成。L-酪氨酸是L-苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,是PAL的不良底物,即Km值較高。酵母菌要在這種結(jié)構(gòu)類似物存在時較好地生長
9、,只能合成更多的PAL。通過類似物篩選系統(tǒng),獲得了大量的突變株,進而從中篩選到PAL活力提高90%以上,遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)菌株ZW115。同時篩選到一株37℃下生長良好,PAL活力提高二倍(與相同培養(yǎng)條件下的出發(fā)菌株相比較),遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)菌株NR128。對突變株ZW115,NR128每日PAL活力進行了研究,其中ZW115和NR128的酶活峰均出現(xiàn)在72小時,PAL活力分別是原始菌株的0.94倍,2.23倍。 盡管對酵
10、母產(chǎn)PAL的分子生物學(xué)研究取得了一些進展,一些酵母完整的PAL基因已經(jīng)獲得并測序,但是有關(guān)Rhodosporidium paludigenum的完整cDNA序列目前尚不清楚。為了獲得PAL基因的全長cDNA序列,本研究根據(jù)Genbank上的紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)PAL蛋白,膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)PAL蛋白,粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)
11、PAL蛋白的氨基酸序列同源比對結(jié)果,選取同源性比較高的區(qū)段設(shè)計簡并引物,優(yōu)化設(shè)計了一對簡并引物。在設(shè)計簡并引物時,選擇同源性相對較低而不是最高的氨基酸序列,另外采用次黃嘌呤核苷酸代替簡并引物中的N,使其簡并度降低到96/64,兩者的退火溫度更加接近。在實驗中采用熱啟動和逐漸升溫PCR技術(shù),成功地擴增出一條650bp的cDNA片段。為了取得JM432 PAL cDNA基因的3'端序列,采用RACE-PCR技術(shù),根據(jù)上述已取得的中間序列設(shè)計
12、合成一條基因特異性引物,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中采用oligo-d(T)接頭引物合成第一鏈cDNA,擴增反應(yīng)中用基因特異性引物和通用接頭引物進行擴增。通過3'RACE-PCR技術(shù)延伸了PAL基因的cDNA序列,獲得650bp的3'端序列。 在5'端序列的克隆中,同樣根據(jù)已取得的中間序列設(shè)計兩對基因特異性引物A1、S1,A2、S2以及末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物。用末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)
13、作用下反轉(zhuǎn)錄總RNA得到第一鏈cDNA,然后使用RNase H分解Hybrid DNA-RNA中的RNA鏈,用T4 RNA連接酶將單鏈cDNA環(huán)化形成首尾連接物。進行PCR擴增時,第一輪擴增用基因特異性引物A1和S1,第二輪擴增采用巢式PCR,以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,利用基因特異性引物A2和S2擴增出未知mRNA的5'端。通過5'RACE-PCR技術(shù)延伸了PAL基因的cDNA序列,獲得了大約1800bp的5'端序列。 將RAC
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