檸條錦雞兒苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的克隆、RNAi載體構(gòu)建和相關(guān)功能分析.pdf

1、本論文以檸條錦雞兒為實驗材料，以木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶PAL為對象，進(jìn)行了酶的純化、酶活性的時空差異、編碼基因的時空表達(dá)、編碼基因片段的克隆、RNAi載體構(gòu)建及RNAi序列對靶酶的調(diào)控效應(yīng)等方面的研究工作。 實驗結(jié)果表明：檸條干種子中存在微弱的PAL活性，當(dāng)種子開始萌動后PAL活性迅速增加，活性比干種子增加近4倍，比活增加5倍多。從萌芽期到硬化期，在實驗樣品的根、莖、葉及相應(yīng)器官中PAL活性和比活均呈現(xiàn)出?。螅〉念悞佄锞€變化。葉器

2、官中PAL活性從子葉期到速生期迅速增加，真葉期比子葉期增加2.2倍，速生期達(dá)到最大，比真葉期增加1.33倍。而硬化期活性降低，硬化期比速生期活性降低21％；莖中PAL活性從子葉期到速生期迅速增加，真葉期比子葉期增加1.48倍，速生期達(dá)到最大，比真葉期增加1.25倍。硬化期時活性大大降低，僅為速生期活性的48％；而根中PAL活性在真葉期達(dá)到最大，真葉期后活性降低，速生期、硬化期的活性分別為真葉期活性的49％和17％。各器官中PAL比活變化

3、與活性變化基本相似。 速生期葉片中的PAL，經(jīng)DEAE52離子交換層析分離，可以得到2個活性峰，分別在鹽離子濃度約為0.4M和0.75M時出現(xiàn)。速生期莖中和真葉期根中的PAL，經(jīng)DE52離子交換層析分離，均得到1個活性峰，在鹽離子濃度約為0.4M時出現(xiàn)。分子篩層析表明：DEAE52中分離到的活性峰均為單一活性峰組分，0.4M鹽離子洗脫峰分子量約為222KD；0.75M鹽離子洗脫峰分子量約為306KD。SDS-PAGE結(jié)果表明：分

4、子量為222KD的PAL全酶是由單一亞基組成的多聚體，亞基分子量為74KD；分子量為306KD的PAL全酶是由2種亞基組成的多聚體，亞基分子量分別為74KD和82KD。 以18SrRNA片段為內(nèi)標(biāo)探針，進(jìn)行的半定量Northern雜交表明：檸條的不同器官和不同發(fā)育階段，pal有不同的表達(dá)量。檸條存在2類pal編碼基因，堿基數(shù)較少的b基因存在于所有樣本中，而堿基數(shù)較多的a基因僅存在于葉片中。根部器官中palb基因的表達(dá)以子葉期為最

5、高，分別約為真葉期、速生期和硬化期的1.24、1.94和5.17倍。莖中該基因以真葉期為最高，分別約為子葉期、速生期和硬化期的2.85、4.61和5.11倍。葉中該基因以真葉期為最高，分別約為子葉期、速生期和硬化期的2.69、3.56和4.48倍。僅存在于檸條葉中的pala基因表達(dá)量變化趨勢與b基因相似，以真葉期為最高，分別是子葉期、速生期和硬化期的2.82、1.93和2.38倍；但(1)a基因表達(dá)量差異比器官中b基因間的差異??；(2)

6、a基因的表達(dá)量比同期b基因的表達(dá)量低，a基因的表達(dá)量與同期pal總表達(dá)量的比值隨發(fā)育而升高。 對用TRIZOL法提取的真葉期、速生期、硬化期莖的RNA，進(jìn)行了質(zhì)量分析，結(jié)果表明：所提RNA樣品中OD260/OD280均超過1.9；在電泳條帶上28S/18S均超過2。 根據(jù)以DNA為模板擴增出的pal序列設(shè)計一對特異引物，以pal表達(dá)量最高的真葉期莖RNA為模板，利用RT-PCR進(jìn)行擴增。擴增片段回收后連接到pGEM-T-

7、Easy載體中，對T載體中插入的pal片段測序，對序列進(jìn)行讀碼分析，登陸NCBI進(jìn)行同源性比對，用DNAMAN軟件與DNA為模板得出的序列進(jìn)行相似性分析。測序結(jié)果表明，RT-PCR擴增出的pal片段大小為564bp，可連續(xù)編碼188個氨基酸。同源性分析表明：該序列與同區(qū)段的Trifoliumsubterran、M.Sative、Manihotesculenta和Phaseolusvulgaris的同源性分別為90.78％、92.9％、8

8、5.11％和89.72％。該基因片段與DNA為模板擴增出的片段相比，在5個位點存在堿基差異。 以pal片段為模板，2對帶不同酶切位點的pal序列為特異引物進(jìn)行PCR擴增，以pBluescript為原始載體，經(jīng)多次亞克隆操作，將來自pHellsgate8的intron和2個擴增的pal片段插入pCAMBIA2300中，插入方式為2個pal擴增片段反向插入到intron兩側(cè)。構(gòu)建成pal相關(guān)的RNAi載體palRNAiq。

9、以農(nóng)桿菌LBA4404為受體菌，將palRNAiq轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采用葉盤法，將農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化到模式植物煙草中。通過卡那對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行初篩，對初篩的轉(zhuǎn)基因煙草，以intron兩側(cè)帶不同酶切位點的pal3’序列為一對引物，進(jìn)行PCR擴增，檢測轉(zhuǎn)基因植株。以帶地高辛標(biāo)記的intron序列為探針，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern雜交、以帶地高辛標(biāo)記的CaMV35S啟動子序列為探針，通過對轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA和單酶切基因組DNA的So

10、uthern雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)基因株驗證。結(jié)果表明：任取10個陽性株進(jìn)行外源基因驗證時，有3株為假陽性。單酶切基因組DNA的Southern雜交結(jié)果還表明在檢測出的7株轉(zhuǎn)palRNAi載體的煙草中，外源基因已整合到轉(zhuǎn)基因煙草的染色體DNA中，但不同轉(zhuǎn)基因植株中外源基因有不同插入位點和不同的拷貝數(shù)。 以帶地高辛標(biāo)記的pal序列為探針，以18SrRNA為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草的Northern雜交實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)palRNAi載體的轉(zhuǎn)基因