山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及功能的初步研究.pdf

1、內(nèi)源毒素β-N-草酰-L-α，β-二氨基丙酸(α-N-oxalyl-L-α，β-diaminopropionic acid，β-ODAP)的存在和較低的有機(jī)硫營(yíng)養(yǎng)水平，限制了山黧豆在干旱、半干旱地區(qū)的推廣。作為β-ODAP生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，CASase)同時(shí)參與腈基的解毒和Cys代謝，這表明CASase可能在β-ODAP與硫代謝平衡中具有重要功能。因此，獲得Ls

2、CASase基因并對(duì)其進(jìn)行功能研究對(duì)于理解β-ODAP調(diào)控機(jī)理及“低毒、高硫”山黧豆品系的培育十分重要。
　　本研究采用同源克隆技術(shù)結(jié)合RACE方法獲得了LsCASase基因的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)分析、RNAi載體構(gòu)建及離體再生體系的構(gòu)建等研究，為進(jìn)一步揭示LsCASase基因表達(dá)與Cys，β-ODAP積累的關(guān)系以及“低毒、高硫”山黧豆的選育奠定分子基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.獲得了

3、1551bp的LsCASase基因cDNA全長(zhǎng)序列。該基因的CDS序列為1146bp，編碼381個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，CASase具有CBS-like蛋白功能結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)并定位于線粒體基質(zhì)，屬于Trp-synth-betaⅡ超家族。CASase蛋白N端存在一個(gè)磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)催化位點(diǎn)和一個(gè)單體相互作用位點(diǎn)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，CASase與擬南芥、大豆CAS蛋白親緣關(guān)系較近，因而以擬南芥CAS蛋白結(jié)構(gòu)為模板，預(yù)測(cè)了

4、山黧豆CASase蛋白的三維結(jié)構(gòu)。另外，分析了LsCASase基因組織特異性表達(dá)。結(jié)果表明LsCASase基因在第6天根中表達(dá)量最高，其后依次是第4天的幼苗、成熟葉、成熟莖;萌發(fā)2天的種子與干種子表達(dá)量幾近相同。
　　2.針對(duì)LsCASase基因中部序列擴(kuò)增RNAi正反義片段;通過BP反應(yīng)得到入門克隆載體pENTR-CASase，經(jīng)由LR反應(yīng)得到表達(dá)克隆載體pSGRNAi-CASase。采用凍融法將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中