霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分離純化、酶學(xué)特性及外界影響因素研究.pdf

1、霍山石斛（Dendrobium huoshanense C．Z．Tang et S．J．Cheng）產(chǎn)于安徽省霍山縣，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的傳統(tǒng)名貴藥用植物；其富含石斛多糖和生物堿等多種生物活性成分，具有益胃生津、滋陰清熱、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等功效。但由于霍山石斛中生物堿含量普遍較低，無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求，因此，加強(qiáng)霍山石斛次生產(chǎn)物合成調(diào)控，提高生物堿含量，促進(jìn)藥用品質(zhì)改善，成為霍山石斛研究中的重點(diǎn)。
　　 苯丙氨酸解氨酶（phen

2、ylalanine ammonia-lyase，PAL，EC4，3.1.5），是苯丙烷類(lèi)代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，其主要催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，可為多種酚類(lèi)、生物堿、類(lèi)黃酮等終產(chǎn)物提供前體物質(zhì)。已有研究表明石斛生物堿含量與PAL活性有關(guān)，PAL可能是石斛屬植物生物堿合成的關(guān)鍵因素之一。研究霍山石斛PAL可以為進(jìn)一步研究PAL在生物堿調(diào)控中的作用機(jī)理提供基礎(chǔ)，還可以為常規(guī)育種或生物技術(shù)育種創(chuàng)造高含量生物堿的霍山石斛提供基礎(chǔ)。本

3、研究以霍山石斛組織培養(yǎng)試管苗為材料，進(jìn)行了PAL的分離純化、基本酶學(xué)性質(zhì)和外界影響因子的研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 采用35％-75％飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、透析袋脫鹽、PEG20000濃縮、DE-52陰離子交換層析和Sephadex G-150凝膠層析對(duì)PAL進(jìn)行分離純化，得到了分離純化的PAL，蛋白質(zhì)得率為1.29％，酶的得率為10.38％，純化倍數(shù)為8。樣品于SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳檢驗(yàn)為單一蛋白帶，說(shuō)明得到了PAL純品

4、。
　　 SDS-PAGE測(cè)量該酶亞基分子量時(shí)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后凝膠上僅有一條帶，說(shuō)明該酶各亞基大小相等；由該帶的相對(duì)遷移率和由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)遷移率所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到該酶的亞基分子量約為50KD。因大多數(shù)植物PAL由4個(gè)相同大小的亞基構(gòu)成，推測(cè)該酶的分子量約為200KD。
　　 純化后的霍山石斛PAL，于210-340nm波長(zhǎng)下進(jìn)行波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，在220nm有肽鍵的強(qiáng)吸收，說(shuō)明可能有共軛體系的存在；在280nm附近

5、處（284nm）有吸收峰，說(shuō)明酶分子中存在含苯基側(cè)鏈的氨基酸殘基。
　　 PAL反應(yīng)進(jìn)程曲線表明，在3h以?xún)?nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)時(shí)間基本成線性關(guān)系。PAL在硼酸緩沖液中最適pH值為pH8.4，在pH8.2-8.6之間有較高的穩(wěn)定性，用pH4.0和pH10.0的緩沖液處理，均會(huì)使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活性降低。PAL最適反應(yīng)溫度是45℃，而且具有較好的耐熱性，60℃處理20min其殘存活性仍保持在50％以上。隨著底物L(fēng)-苯丙氨酸濃

6、度的逐漸增大，酶的活性也逐漸增大，最適底物濃度為2mmol/L。以D-苯丙氨酸、L-酪氨酸代替L-苯丙氨酸作為霍山石斛PAL反應(yīng)底物，L-Phe作為反應(yīng)底物與D-Phe及L-Tyr作為反應(yīng)底物對(duì)PAL活性影響的差異達(dá)到極顯著水平，差異達(dá)到1％極顯著水平。而隨著酶液濃度的增加，反應(yīng)速度也隨之增加，當(dāng)酶液量達(dá)到一定時(shí)，反應(yīng)速度突然加快，當(dāng)達(dá)到更高濃度之后反應(yīng)速度將減緩。用Lineweaver-Burk法進(jìn)行雙倒數(shù)作圖，計(jì)算得兩個(gè)Km值分別為

7、：Kml為0.4425×10-3mol/L，Km2為0.847×104mol/L，貯存實(shí)驗(yàn)證明該酶最好在-20℃下用甘油貯存。
　　 重金屬AgNO3，HgCl2都能不同程度地抑制酶活性，且兩者對(duì)PAL活性的抑制均達(dá)到極顯著水平。EDTA、EDTA-Na2對(duì)PAL都有較強(qiáng)的抑制作用，但與對(duì)照相比，EDTA-Na2處理差異不顯著，而EDTA差異極顯著。AlCl3、ZnSO4、MnSO4、MgSO4都不同程度地促進(jìn)PAL的活性，但與

8、對(duì)照相比差異均未達(dá)到極顯著，最佳處理效果為AlCl3>ZnSO4>MgSO4>MnSO4；在供試濃度范圍內(nèi)，最佳處理濃度為AlCl31mmol/L、ZnSO41mmol/L、MgSO42mmol/L、MnSO41mmol/L。而CuSO4、CaCl2（0.5mmol/L除外）都不同程度地抑制酶的活性，與對(duì)照相比CuSO4差異極顯著，CaCl2處理差異不顯著。Al3+鹽不同形態(tài)對(duì)PAL酶活性影響不同，AlCl3、Al2（SO4）3均能促進(jìn)