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文檔簡介
1、目的:
本課題首先對前列腺癌PC-3細胞小規(guī)模體外二維到三維靜止培養(yǎng)條件的逐步優(yōu)化,后在wave20/50生物反應器中利用2L-cell-bag和微載體cytodex3對PC-3細胞動態(tài)培養(yǎng)過程中的擺動方式和營養(yǎng)條件的進一步優(yōu)化,從而建立了一個適合PC-3細胞在波浪式生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)的新型平臺,為今后的動物實驗和腫瘤細胞疫苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了基礎。
方法:
1.PC-3細胞二維靜止培養(yǎng)的條件優(yōu)化:
2、r> 在二維培養(yǎng)皿中利用24孔板對PC-3細胞的基本生長特性,種子細胞培養(yǎng)基進行優(yōu)化,從文獻查閱常用的四種培養(yǎng)基中選出PC-3細胞生長形態(tài)最好,達到對數(shù)期時間最短,生長密度最高的培養(yǎng)基,用倒置顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài),用血球計數(shù)板繪制細胞的生長曲線。
2.PC-3細胞三維靜態(tài)培養(yǎng)的條件優(yōu)化:
在10cm細菌培養(yǎng)皿中對微載體的初始接種密度,細胞的初始接神密度,微載體的類型cytodex1和cytodex3,血清濃度,
3、培養(yǎng)基,擴大培養(yǎng)方式,新舊球的加入比例等條件的優(yōu)化,使用細胞動力學分析細胞生長活力,通過倒置顯微鏡觀察細胞在微載體上的貼壁和生長狀態(tài),用0.1%結(jié)晶紫檸檬酸染液對細胞核染色并繪制生長曲線,用葡萄糖和乳酸試劑盒,對細胞的營養(yǎng)代謝情況在酶標儀進行監(jiān)測。
3.PC-3細胞三維動態(tài)培養(yǎng)的條件優(yōu)化:
在wave20/50生物反應器中利用2L-cell-bag,設定5%CO237℃,0.01通氣流速的情況下,對PC-3細胞在小規(guī)
4、模三維靜止的條件基礎上分別采取全擺動,不擺動,間隙擺動的培養(yǎng)方式在wave20/50生物反應器中培養(yǎng),考察了培養(yǎng)基中不同起始血清濃度對PC-3細胞貼壁和生長的影響;營養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖)的補充對PC-3細胞生長的影響;通過繪制生長曲線和觀察細胞生長狀態(tài),監(jiān)測葡萄糖和乳酸代謝情況,收獲細胞數(shù)等參數(shù)進行最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化。
采用流式細胞分析儀對微載體培養(yǎng)的PC-3細胞膜表面生物素化和hGM-CSF蛋白的修飾功能進行鑒定。
結(jié)
5、果:
1.在二維靜止培養(yǎng)方式中,使用了四種含10%FBS的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)PC-3細胞,其中選取含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基作為種子細胞培養(yǎng)基,其PC-3細胞的分泌顆粒物最少,細胞形態(tài)呈飽滿梭形,細胞內(nèi)空泡較少,細胞老化速度慢,最大細胞密度達到1.26x106cell/ml,固選為種子培養(yǎng)基對其進行擴大培養(yǎng)。
2.在3D靜止培養(yǎng)體系,我們選擇以3g/l cytodex3和2x105cell/ml細胞密度的接種
6、條件,比較了不同起始血清濃度(10%,5%,2%,0%FBS)對PC-3細胞生長狀況的影響,血清濃度和細胞的最大密度成正相關;隨后比較了雙相血清濃度培養(yǎng)方法,其中起始血清濃度為10% RPMI1640待細胞貼壁后將血清濃度降至5%與全程使用10%FBS培養(yǎng)的生長曲線基本相似,相對于全程使用5%FBS的培養(yǎng)基細胞密度分別提高了1.7和1.64倍。
3.PC-3細胞在cytodex3靜止的培養(yǎng)條件下,在10cm2細菌培養(yǎng)皿中對其貼
7、滿載體的細胞進行不消化直接接種新舊球比例為1∶1-2∶1時,細胞可以通過“僑聯(lián)”的作用貼滿新球,在模擬細胞循環(huán)培養(yǎng)體系中對培養(yǎng)基進行每天半量換液的操作,建立了一種小規(guī)模模擬球轉(zhuǎn)球傳代的培養(yǎng)方式,為后期PC-3細胞的大規(guī)模擴大培養(yǎng)奠定了基礎。
4.在3D動態(tài)培養(yǎng)方式中,使用微載體3g/l cytodex3和2x105cell/ml細胞密度的接種條件下,利用wave20/50生物反應器在2L細胞培養(yǎng)袋500ml的培養(yǎng)體積中,結(jié)合氣
8、體和溫度易于控制,在波浪式生物反應器中采取靜止——間隔——連續(xù)擺動的培養(yǎng)方式(待細胞在微載體貼壁后逐步提高轉(zhuǎn)動時間,擺動角度為5°6-9rpm范圍內(nèi),利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣傳遞率的擴散),最終收獲細胞為5.3x108cells,相對于靜止培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)分別提高了1.42和2.54倍,建立了一種適合wave20/50生物反應器動態(tài)培養(yǎng)PC-3細胞的平臺。
5.在wave20/50生物反應器微載體1L培養(yǎng)體系中,在每天50%換的培養(yǎng)基
9、中補充1g/l的葡萄糖,血清濃度降到2%的條件下,相對于不添加葡萄糖的培養(yǎng)基,細胞在微載體上的貼壁時間更久,細胞在微載體上伸展的形態(tài)更好,細胞最大密度1.23x106cell/ml,與對照組相比高1.24倍,最終細胞收獲數(shù)為8.53x108cells,相比對照組,提高了1.18倍。
6.流式細胞分析儀檢測二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的PC-3細胞的膜表面蛋白修飾效率均達95%以上,說明此微載體培養(yǎng)PC-3細胞的平臺可以用于前列腺癌疫苗的
10、大規(guī)模制備。
結(jié)論:
本課題是利用微載體培養(yǎng)技術,建立了一種適合PC-3細胞在wave20/50生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)平臺,并經(jīng)過多次實驗對PC-3細胞三維培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,創(chuàng)建了雙相血清濃度和間隔擺動的培養(yǎng)方式,在2L細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)PC-3的最終細胞數(shù)約達109cells的產(chǎn)量,為動物實驗高密度腫瘤疫苗的需求和后期臨床實驗研究奠定了基礎。
本課題的成功實施將使細胞膜表面修飾的腫瘤細胞疫苗的研制水平更進一
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