尿肌氨酸LC-MS檢測方法的建立及其在前列腺癌中的診斷應(yīng)用與機制研究.pdf

1、【目的】
　　建立同位素稀釋的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法測定肌酐校正后尿肌氨酸的含量，對該方法進行完整的方法學(xué)評估。應(yīng)用該方法對前列腺癌、健康和疾病對照尿液樣本中肌氨酸含量進行檢測，并評價尿肌氨酸在前列腺癌診斷中的應(yīng)用。以miRNA為切入點，研究與肌氨酸代謝密切相關(guān)基因GNMT和DMGDH在前列腺癌中的表達情況，初步探討其在肌氨酸代謝中的可能機制。
　　【方法】
　?。?）方法建立及評估。收集2014年5月至2014年10月

2、入院的前列腺癌（PCa）患者36例，良性前列腺增生（BPH）患者15例和我院健康體檢患者122例，隨機尿5 mL。以穩(wěn)定同位素標(biāo)記[2H3]-肌氨酸作為內(nèi)標(biāo)，首先使用丹磺酰氯對肌氨酸進行柱前衍生，應(yīng)用ID-LC-MS技術(shù)同時測定尿肌氨酸和肌酐含量。同時評價該方法的線性、最低檢出限、精密度和回收率，并與酶法比較一致性。
　?。?）尿肌氨酸的臨床應(yīng)用。比較前列腺癌患者、良性前列腺增生患者及健康人群的尿肌氨酸/肌酐水平，并通過ROC曲線

3、評價尿肌氨酸對前列腺癌診斷及良性前列腺增生鑒別診斷的效果；比較不同病理分級和分期的前列腺癌患者的尿肌氨酸/肌酐水平；研究尿肌氨酸與PSA比值聯(lián)合診斷的意義；初步確定正常人尿肌氨酸的參考范圍。
　?。?）通過realtime PCR檢測參與肌氨酸代謝基因GNMT和DMGDH及其潛在相關(guān)miRNA在人前列腺癌細胞株LNCaP、DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達水平，并以ID-LC-MS法測定培養(yǎng)上清中的肌

4、氨酸濃度。
　　【結(jié)果】
　?。?）用ID-LC-MS法在本實驗條件下檢測尿肌氨酸特異性高，與同分異構(gòu)體完全分離亦未見明顯干擾因素。尿肌氨酸線性方程為Y=2.0456X+0.0689，R2=0.995；檢測限（LOD）為8 ng/mL，定量限（LOQ）為25 ng/mL；批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）均<6％；回收率范圍96.8%~105.1%；ID-LC-MS法與酶法結(jié)果具有相關(guān)性，R2=0.815，P<0.01，平均偏差為-

5、37.1%。
　?。?）PCa組尿肌氨酸/肌酐水平顯著高于健康人群（P<0.001）和BPH組（P<0.05）；尿肌氨酸/肌酐水平在健康人群組與BPH組中無明顯差異；分析非PCa組（健康人和BPH）與PCa組的尿肌氨酸/肌酐ROC曲線，其截斷值為0.286 mg/g，靈敏度為75%，特異性為90.79%，曲線下面積為0.871；分析各指標(biāo)鑒別診斷BPH和PCa的ROC曲線，得出PSA比值和尿肌氨酸/肌酐的兩指標(biāo)AUC值分別為0.7

6、00和0.752。
　　（3）相較于其他前列腺癌細胞株和正常前列腺上皮細胞，LNCaP細胞中GNMT的基因表達顯著升高，該細胞培養(yǎng)上清的肌氨酸水平也顯著升高；miR-15a及miR-146b在PCa細胞系中表達均有不同程度下降。
　　【結(jié)論】
　?。?）成功建立ID-LC-MS測定尿液肌氨酸方法，該方法具有良好的特異性、靈敏度和可重復(fù)性，能夠作為前列腺癌診斷的可靠技術(shù)平臺。
　?。?）應(yīng)用上述方法，結(jié)果顯示PCa