菹草紅色類胡蘿卜素的結構表征及其抽提物生理活性研究.pdf

1、菹草(PotamogetoncrispusL.)是眼子菜科沉水維管束植物，廣泛分布于湖泊、水庫和溝渠等地，湖區(qū)的蛋鴨采食菹草后能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的紅心鴨蛋，但其原因一直不明。而且鮮菹草生長的季節(jié)性很強，因而紅心蛋的生產(chǎn)受到很大限制。國內(nèi)外大量研究表明，蛋黃色澤與飼料中類胡蘿卜素的種類和含量密切相關。類胡蘿卜素不僅是重要的天然色素，而且具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細胞生長等生物活性。本實驗室的初步研究表明：這種紅心蛋的類胡蘿卜素提取物可顯著抑制

2、腫瘤細胞S180的生長，因此對菹草類胡蘿卜素進行深入系統(tǒng)的研究具有重要意義。本課題綜合運用了化學分析、色譜、光譜及質(zhì)譜等現(xiàn)代儀器分析技術和方法，將菹草和紅心鴨蛋中的類胡蘿卜素進行了對比研究，確定了菹草中特殊紅色類胡蘿卜素的化學結構；采用細胞分子生物學前沿技術和手段，探討了菹草類胡蘿卜素抽提物對人肝癌細胞株QGY-7703生長抑制和對癌細胞凋亡的影響；運用食品及飼料加工新技術，研制開發(fā)了紅心蛋專用菹草功能顆粒飼料。本研究為深度開發(fā)利用菹草

3、資源、實現(xiàn)菹草顆粒飼料及紅心蛋功能產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化奠定了堅實基礎。主要研究內(nèi)容及成果如下：1對菹草和紅心鴨蛋蛋黃類胡蘿卜素的特性進行了初步比較研究，建立了菹草紅色類胡蘿卜素的分離、純化和制備方法1.1用有機溶劑浸提凍干菹草類胡蘿卜素的最佳參數(shù)條件是：浸提液為石油醚－丙酮(1：3，v/v)混合溶劑，料液比為90(mL/g)，在常溫下分3次浸提，總浸提時間為1.5h。凍干菹草粉總類胡蘿卜素的含量為552.57mg/kg，在此條件下其總類胡蘿卜素

4、的提取率可達95.5％。 1.2菹草中的紅色類胡蘿卜素和部分黃色類胡蘿卜素與采食菹草的蛋鴨所產(chǎn)紅心蛋蛋黃色素有很好的對應關系，此紅心鴨蛋的紅色類胡蘿卜素來源于菹草。 1.3采用氧化鎂-硅藻土(1：2，w/w)柱層析、硅膠G薄層層析可從菹草總類胡蘿卜素中分離純化得到3個紅色類胡蘿卜素組分r1、r2和r3，其Rr分別為0.32、0.34和0.38；薄層層析展開劑為正己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲醇=27：4：2：2(v/v/v/v

5、)。 2對菹草紅色類胡蘿卜素r1、r2和r3的化學結構進行了表征用紫外可見吸收光譜、紅外光譜、拉曼光譜、高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用分析、低分辨和高分辨電子轟擊質(zhì)譜及其它理化分析研究了菹草紅色類胡蘿卜素r1、r2和r3的化學特性和結構，主要結論是：2.1r1、r2和r3在丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二硫化碳中的紫外可見吸收光譜均為比較平滑對稱的單峰(對應的最大吸收波長為λmax)，在正己烷中則呈現(xiàn)不對稱“三指狀”譜峰的趨勢，與正己烷

6、相比，隨溶劑極性增強，λmax增大；從總體平均趨勢看：r1、r2和r3的λmax依次減小(藍移)幾個nm。r1、r2和r3的紅外光譜表明它們是含羰基多烯化合物，其拉曼光譜特性表明它們均具有類胡蘿卜素的基本碳架結構，其測試反應表明它們的分子中含羰基，而不含5，6或5，8-環(huán)氧基團。結果充分證明：r1、r2和r3是含有共軛多烯鏈和羰基的類胡蘿卜素化合物，與蝦青素、角黃素和β-胡蘿卜素結構不同，且r1、r2和r3之間的細微結構不同。

7、2.2經(jīng)高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用和低分辨電子轟擊質(zhì)譜分析得到r1、r2和r3的相對分子質(zhì)量均為562；經(jīng)高分辨電子轟擊質(zhì)譜分析得到r1、r2和r3的精確相對分子質(zhì)量分別為562.38164、562.38146和562.38002。綜合分析表明：r1、r2和r3的元素組成相同40C：50H：20，即它們的分子式均為C40H50O2、相對分子質(zhì)量均為562。 2.3將r1、r2和r3與從紫杉漿果中分離純化的紅色素Tr1、Tr2和

8、Tr3進行了薄層層析、紫外可見光譜和質(zhì)譜分析，結果表明：r1、r2及r3和Tr1、Tr2及Tr3是完全對應的化合物。 根據(jù)以上研究結果，綜合分析確認：菹草紅色類胡蘿卜素r1、r2和r3三者分子式均為C40H50O2、相對分子質(zhì)量均為562，而且都是含有羰基的類胡蘿卜素，它們與紫杉紫素(Rhodoxanthin)具有相同的基本結構，是紫杉紫素的同分異構體(順反異構體)；根據(jù)波譜分析，初步推測r1可能是全反式異構體，而r2和r3可能

9、是順式異構體。 3探討了菹草類胡蘿卜素抽提物(CEPC)對人肝癌細胞株QGY-7703生長抑制和癌細胞凋亡的影響 以人肝癌細胞株QGY-7703為材料，采用細胞培養(yǎng)為基本方法，分別用含10、20、40和60μmol/L的CEPC培養(yǎng)液對QGY-7703細胞進行了處理。用MTT法檢測細胞存活率，用可見光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察細胞形態(tài)的變化，用LSCM觀測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，用流式細胞儀

10、檢測細胞周期變化等綜合手段，研究了菹草類胡蘿卜素抽提物(CEPC)對人肝癌細胞生長抑制和癌細胞凋亡的影響。由實驗得到的結論是：CEPC對QGY-7703細胞的生長具有明顯的抑制作用，且在一定程度上呈時間-效應和劑量-效應依賴關系。在較短的時間內(nèi)(48h)及使用較小的CEPC劑量(10μmol/L和20μmol/L)就能有效地誘導QGY-7703細胞凋亡，CEPC使QGY-7703細胞周期阻滯于G0/G1期。CEPC能極顯著提高QGY-7

11、703細胞胞內(nèi)Ca2+濃度。由于Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使，在細胞凋亡過程中起著重要作用，細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，可能激活相應的蛋白激酶和磷酸酶，最終導致凋亡發(fā)生。因此，CEPC處理QGY-7703細胞后使胞內(nèi)Ca2+濃度較大幅度升高可能是導致人肝癌細胞發(fā)生凋亡的機制之一。本項研究結果提示：菹草類胡蘿卜素抽提物具有很強的抗肝癌作用，具有進一步研究和開發(fā)的價值。 4菹草功能性紅心蛋顆粒飼料的研制開發(fā)及蛋鴨喂養(yǎng)試驗采用干燥脫

12、水、粉碎、造粒和包裝的工藝，將鮮菹草加工成了顆粒飼料(濃縮料)，并實現(xiàn)了菹草顆粒飼料的中試生產(chǎn)。通過蛋鴨喂養(yǎng)試驗和成分分析對菹草顆粒飼料的功能和價值進行了評價。 4.1蛋鴨喂養(yǎng)試驗結果表明：在一定范圍內(nèi)，菹草顆粒的添加量與紅心蛋的平均色度、色度在15度以上紅心蛋所占比例呈現(xiàn)一定的量效關系。將20％的菹草顆粒與80％的普通蛋鴨配合飼料混合組成的飼料綜合效果最好，喂養(yǎng)第4d即使蛋黃平均色度由對照組的7度上升到15度，其差異達到極顯著

13、水平(P＜0.01)；喂養(yǎng)13d、14d時色度15度以上紅心蛋占所產(chǎn)蛋總數(shù)的80％，并全部達到14度以上；該試驗組飼料可顯著增加平均蛋重(P＜0.05)，而且維持很高的產(chǎn)蛋率。 4.2對本課題組中試生產(chǎn)的菹草粉、菹草顆粒及試驗優(yōu)選的紅心蛋顆粒飼料進行了理化和營養(yǎng)成分檢測，結果表明：菹草粉的粗蛋白含量為13.36％、總類胡蘿卜素的含量為463.1mg/kg，兩者都大大高于玉米，而粗蛋白與小麥麩相近；菹草顆粒的主要成分含量分別為：干

14、物質(zhì)90.05％、粗蛋白12.96％、粗脂肪4.36％、粗纖維4.75％、無氮浸出物54.16％、粗灰分13.82％、鈣1.72％、總磷0.24％。配制的紅心蛋顆粒飼料的主要指標符合部頒標準(SB/T10262-1996生長鴨、產(chǎn)蛋鴨、肉用仔鴨配合飼料)的要求。由于菹草粉和菹草顆粒飼料含有多種營養(yǎng)成分，具有較全面的營養(yǎng)價值，特別是它含較高的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、類胡蘿卜素及其它維生素，將它以一定比例與普通蛋鴨飼料混合，營養(yǎng)成分得到進一步的

15、互補和優(yōu)化，這可能是菹草顆粒飼料在提高蛋黃色度的同時、又能促進蛋鴨生長、增加蛋重、維持較高產(chǎn)蛋率的重要原因。菹草顆粒飼料的功能和價值體現(xiàn)在它具有禽蛋賦色、營養(yǎng)和保健功能，而且其配制和使用易于實現(xiàn)標準化，儲運方便，具有良好的應用前景。 本研究受到了教育部博士點基金項目(20020504008)、湖北省科技攻關計劃項目(2003AA204B07)及有關企業(yè)的資助。本項目基礎研究和應用開發(fā)的順利完成，有利于充分開發(fā)豐富的野生菹草資源，