脊髓損傷后BDNF對(duì)損傷局部炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞極性的調(diào)解作用.pdf

1、大量研究證實(shí)脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BrainDerived Neurotrophic Factor，BDNF)可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)而抑制神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)軸突再生，調(diào)節(jié)突觸傳遞，增強(qiáng)神經(jīng)興奮性，促進(jìn)前體細(xì)胞的增殖和髓鞘再生。盡管有研究顯示BDNF具有抗炎抗氧化作用，并且對(duì)免疫反應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，但SCI后BDNF對(duì)炎癥反應(yīng)的影響尚不明確。本課題通過(guò)系列研究證實(shí)

2、SCI后損傷局部過(guò)表達(dá)BDNF可以明顯改善炎癥微環(huán)境，抑制促炎因子(IL-1β，TNF-a)的表達(dá)并上調(diào)抑炎因子(IL-10，IL-13)的表達(dá)，同時(shí)可以促進(jìn)損傷區(qū)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變。此外，BDNF對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)解在一定程度上增強(qiáng)了其神經(jīng)保護(hù)作用并顯著促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　第一部分:SCI后損傷中心處注射Lenti-BDNF載體成功過(guò)表達(dá)并以轉(zhuǎn)染損傷局部炎癥細(xì)胞為主
　　材料與方法：
　　1

3、.Lenti-BDNF載體構(gòu)建;BDNF基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的BDNF基因片段交換入線(xiàn)性化GV208表達(dá)載體，獲得GV208-BDNF慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆菌落行PCR鑒定，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序后將其與慢病毒包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，最后通過(guò)Real-time PCR法進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)。
　　2.C57BL/6脊髓損傷模型建立;通過(guò)建立兩種常用SCI動(dòng)物模型，T10節(jié)段背側(cè)半切模型和T10

4、節(jié)段動(dòng)脈夾夾傷模型。選擇適合于本課題慢病毒載體注射的SCI模型。
　　3.損傷中心處Lenti-EGFP和Lenti-BDNF注射以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞種類(lèi)的鑒定;
　　通過(guò)立體定向儀以及漢密爾頓微量進(jìn)樣器向損傷中心處注射慢病毒載體，通過(guò)對(duì)損傷節(jié)段進(jìn)行CD11b和GFAP免疫熒光染色，明確慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞種類(lèi)。
　　4.各組損傷節(jié)段BDNF表達(dá)水平檢測(cè);慢病毒載體注射后第4天，通過(guò)ELISA檢測(cè)各組損傷節(jié)段(自損傷中心處向頭側(cè)和尾

5、側(cè)各1.5mm) BDNF的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.GV208-BDNF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆鑒定顯示測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列比對(duì)完全一致。慢病毒包裝后Real time PCR法測(cè)定病毒滴度為2.00E+8TU/ml。
　　2.T10節(jié)段背側(cè)半切模型和動(dòng)脈夾夾傷模型都可以破壞小鼠的皮質(zhì)脊髓束(CST)并造成后肢運(yùn)動(dòng)功能的喪失，但夾傷模型能夠更好的保護(hù)硬脊膜，減少病毒流失，更適合本課題研究。
　　3.慢病毒注射后

6、4天（脊髓損傷后第7天），共聚焦結(jié)果顯示EGFP細(xì)胞廣泛分布在損傷中心處，并且在轉(zhuǎn)染EGFP的細(xì)胞中，CD11b陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分在lenti-EGFP和Lenti-BDNF組中均達(dá)到了80％以上，說(shuō)明在損傷中心灶注射的慢病毒載體主要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為損傷局部的炎癥細(xì)胞。
　　4.通過(guò)ELISA對(duì)損傷節(jié)段處BDNF的總體表達(dá)水平檢測(cè)顯示lenti-BDNF組(62.63±8.74 ng/g)的表達(dá)水平明顯高于lenti-EGFP組(0.

7、59±0.15 ng/g)以及saline組(0.68±0.13 ng/g)(P＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　1.Lenti-BDNF慢病毒包裝成功，病毒滴度較高，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要。
　　2.改良動(dòng)脈夾夾傷模型能夠更好的保護(hù)硬脊膜完整，更適合損傷局部慢病毒注射。
　　3.損傷中心處注射的慢病毒載體主要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為損傷局部的炎癥細(xì)胞。此種注射方法有利于對(duì)BDNF在免疫炎癥調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行研究。
　　4.通

8、過(guò)ELISA定量檢測(cè)證實(shí)，Lenti-BDNF載體在損傷節(jié)段成功過(guò)表達(dá)。
　　第二部分：SCI后損傷處過(guò)表達(dá)BDNF在免疫炎癥調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)中具有顯著作用
　　第一節(jié):損傷中心處過(guò)表達(dá)BDNF可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變并對(duì)炎癥微環(huán)境具有明顯的調(diào)解作用
　　材料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象;成年雌性C57BL/6小鼠跟據(jù)注射載體的不同分為:Lenti-EGFP組，Lenti-BDNF組和Saline組（于損

9、傷中心處注射生理鹽水）以及Sham組（僅進(jìn)行椎板切除，不對(duì)脊髓造成損傷）。
　　2.通過(guò)免疫熒光對(duì)巨噬細(xì)胞表型進(jìn)行檢測(cè);對(duì)各組損傷組織切片進(jìn)行CD16/32（M1標(biāo)記物）和Arginase-1（M2標(biāo)記物）免疫熒光標(biāo)記，檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞表型的變化。
　　3.通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行M1/M2表型檢測(cè)分析;對(duì)損傷節(jié)段進(jìn)行取材（損傷中心至頭側(cè)和尾側(cè)各1.5mm），消化，洗滌，過(guò)濾后獲得單細(xì)胞懸液，然后予以M1表型(CD16/32，iN

10、OS，)和M2表型(arginase-1，CD206)流式抗體孵育及檢測(cè)。
　　4.炎癥因子的表達(dá)水平檢測(cè);對(duì)各組損傷節(jié)段促炎因子(TNF-a，IL-1β)和抑炎因子(IL-10，IL-13)的表達(dá)水平進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
　　5.在體外培養(yǎng)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDM)過(guò)程中進(jìn)行BDNF刺激，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)水平以及通過(guò)Western Blot檢測(cè)arginase-1和iNOS的蛋白表達(dá)水平，以明確BD

11、NF是否可以直接作用于對(duì)巨噬并對(duì)其表型產(chǎn)生影響。
　　結(jié)果：
　　1.共聚焦結(jié)果顯示脊髓損傷后lenti-BDNF組arginase-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相比lenti-EGFP組和saline組明顯增多(P＜0.05)，而lenti-BDNF組CD16/32陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比lenti-EGFP組和saline組明顯減少（P＜0.05）。此外，與Lenti-EGFP組相比Lenti-BDNF組中未與EGFP共定位的Arginase-1+

12、細(xì)胞百分比明顯升高，同時(shí)未與EGFP共定位的CD16/32+細(xì)胞百分比顯著降低(P＜0.05)。
　　2.流式結(jié)果分析顯示，與lenti-EGFP組和saline組相比，lenti-BDNF組中與M1表型相關(guān)的CD16/32和iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯下降，而與M2表型相關(guān)的arginase-1和CD206陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著上升。
　　3.ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示損傷局部過(guò)表達(dá)BDNF可以明顯降低促炎因子IL-1β和TNF-α

13、的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)抑炎因子IL-10和IL-13的表達(dá)。
　　4.在體外試驗(yàn)中，qRT-PCR檢測(cè)經(jīng)BDNF刺激的BMDM的炎癥因子的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，Western Blot檢測(cè)表型相關(guān)蛋白arginase-1和iNOS的表達(dá)與對(duì)照組亦無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.SCI后損傷中心處過(guò)表達(dá)BDNF可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2表型轉(zhuǎn)變，并且初步分析顯示，損傷處巨噬細(xì)胞極性的轉(zhuǎn)變可能并非通過(guò)BDNF直接作用于

14、巨噬細(xì)胞引起的。
　　2.過(guò)表達(dá)BDNF可以抑制促炎因子的表達(dá)并上調(diào)抑炎因子的表達(dá)水平，在改善炎癥微環(huán)境中具有一定的作用。
　　3.體外重組BDNF刺激BMDM后，并未引起巨噬細(xì)胞表型的改變，表明重組BDNF不能直接作用于巨噬細(xì)胞。
　　第二節(jié):損傷中心處過(guò)表達(dá)BDNF可以促進(jìn)SCI后的神經(jīng)損傷修復(fù)
　　材料和方法：
　　1.運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估;通過(guò)曠場(chǎng)試驗(yàn)對(duì)Lenti-EGFP和Lenti-BDNF兩組小鼠的行

15、為學(xué)予以Basso Mouse Scale(BMS)評(píng)分，以評(píng)價(jià)BDNF對(duì)SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。
　　2.脫髓鞘檢測(cè);通過(guò)對(duì)Lenti-EGFP和Lenti-BDNF組脊髓損傷節(jié)段矢狀位切片進(jìn)行Luxol Fast Blue(LFB)染色，以評(píng)估BDNF對(duì)髓鞘的保護(hù)作用。
　　3.BDA(Biotinylated dextran amine)示蹤;脊髓損傷后14天向小鼠運(yùn)動(dòng)皮層予以BDA注射，對(duì)損傷后的皮質(zhì)脊髓束(CS

16、T)進(jìn)行示蹤，觀察BDNF對(duì)CST軸突回縮的影響。
　　4.對(duì)損傷局部神經(jīng)纖維的影響;通過(guò)對(duì)Lenti-EGFP和Lenti-BDNF損傷節(jié)段進(jìn)行NF-200免疫熒光染色，觀察BDNF對(duì)損傷局部神經(jīng)纖維的影響。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)對(duì)兩組小鼠損傷后1，3，7，14，28天進(jìn)行BMS評(píng)分顯示，亞急性期Lenti-BDNF組的小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較Lenti-EGFP組明顯提高。
　　2.LFB染色結(jié)果顯示Lenti

17、-BDNF組脫髓鞘程度較Lenti-EGFP組明顯減輕。
　　3.結(jié)果顯示Lenti-BDNF組CST軸突末端距離損傷邊緣較Lenti-EGFP組明顯縮短，表明過(guò)表達(dá)BDNF可以顯著減少CST的軸突回縮。
　　4.NF-200免疫熒光染色結(jié)果顯示損傷中心處過(guò)表達(dá)BDNF可以明顯抑制神經(jīng)纖維的崩解，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　SCI后損傷局部過(guò)表達(dá)BDNF能顯著促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用