Purα對PARP1基因表達調(diào)控作用及在DNA損傷修復(fù)中作用機制研究.pdf

1、目的：Purα是一種多功能蛋白質(zhì)，在體內(nèi)的多個環(huán)節(jié)上都發(fā)揮著重要的作用，特別在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著更為重要的作用。Purα蛋白質(zhì)在對DNA損傷與修復(fù)中的作用是非常明顯的。有研究也表明在由復(fù)制叉終止引起的DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)修復(fù)中，Purα蛋白對修復(fù)的DNA起著監(jiān)督的作用，這有助于維持基因組的穩(wěn)定性，在神經(jīng)退行性病變的發(fā)生中有著重要的意義。Purα的表達有特異性，與神經(jīng)元的發(fā)育

2、和突觸形成有密切的關(guān)系。PARP1是存在于真核細胞中催化聚ADP核糖化的核酶。它能識別極低水平的DNA損傷，激活相應(yīng)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)受損的DNA；而在DNA損傷嚴重時，它能啟動細胞凋亡程序，從而維持了細胞遺傳物質(zhì)的完整性。我們前期的實驗結(jié)果已經(jīng)證實，Purα蛋白與PARP1蛋白有相互結(jié)合作用。然而，Purα蛋白是否調(diào)控PARP1基因的表達，如何進行調(diào)控，正調(diào)控還是負調(diào)控，Purα蛋白的活性功能域究竟位于什么地方，目前仍然不是十

3、分清楚。我們的實驗?zāi)康氖峭ㄟ^研究過表達Purα蛋白對PARP1基因表達的影響來確定Purα蛋白對PARP1基因表達的調(diào)控作用。同時，通過研究Purα缺失突變體對PARP1基因的作用效果來確定Purα蛋白的活性結(jié)構(gòu)域。此外，我們也通過研究Purα缺失突變體對APP基因的作用效果進一步來確定Purα蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用中的活性結(jié)構(gòu)域。
　　方法：（1）根據(jù)基因序列設(shè)計引物，通過PCR擴增Purα基因的不同的缺失片段，構(gòu)建與GFP融合表達

4、的Purα缺失突變體（pEGFP-P1、pEGFP-P2、pEGFP-P3和pEGFP-P4）質(zhì)粒。（2）通過Pull down Assay和Co-IP，進一步檢測Purα和PARP1的Physical interaction,即兩種蛋白之間是否存在實質(zhì)性的結(jié)合。（3）在HT22細胞中，通過Luciferase Assay，Real time PCR和Western blotting assay分別在啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平研究Purα蛋

5、白及其結(jié)構(gòu)突變體對PARP1基因的調(diào)控作用。（4）用2mM的羥基脲(hydroxyurea,HU)建立HT22細胞DNA損傷模型，通過免疫熒光技術(shù)觀察兩種蛋白在DNA損傷的細胞內(nèi)的分布。同時，通過Western blotting assay研究過表達的Purα對PARP1蛋白的影響。（5）在HT22細胞中，通過研究過表達的Purα蛋白對mTOR通路中的信號分子的影響來探討Purα對PARP1蛋白的作用機制。
　　結(jié)果：（1）經(jīng)雙酶

6、切鑒定和質(zhì)粒序列分析結(jié)果證明pEGFP-Purα缺失突變體質(zhì)粒構(gòu)建成功。（2）Pull down assay和Co-IP實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Purα蛋白和PARP1蛋白存在相互結(jié)合作用。（3）Luciferase Assay、Real time PCR和Western blotting assay結(jié)果證實全長Purα對PARP1基因有明顯的正向調(diào)控作用，四個突變體中P3對PARP1和APP的調(diào)控作用最為顯著。（4）DNA損傷模型下，Purα蛋白

7、和PARP1蛋白存在共區(qū)域化的現(xiàn)象。同時，Western blotting assay表明Purα蛋白可以促進PARP1發(fā)揮其生物學功能，兩種蛋白對DNA損傷的修復(fù)有協(xié)同作用。（5）Western blotting assay發(fā)現(xiàn)Purα蛋白是通過mTOR通路來調(diào)控PARP1基因的表達。
　　結(jié)論：(1)Purα蛋白和PARP1蛋白之間有直接的結(jié)合作用（Physical interaction）。（2）Purα蛋白可以正向調(diào)控PA