β3GnT-8 siRNA的設(shè)計(jì)和篩選及該基因與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的:β1,3葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8(β3Gn-T8),又名β1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶7(β3GalT7),是本課題組首先在國(guó)際上克隆獲得的人類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶新基因。已有研究表明該酶可能與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本文通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了B3Gn-T8與癌癥浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的聯(lián)系,并且通過(guò)RNA干擾技術(shù)和真核正義表達(dá)載體技術(shù)研究了β3Gn-T8對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS中相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,以期為胃癌治療提供新的途徑。
　　 方法:
　　 1

2、.遵循RNA干擾目標(biāo)序列的選取原則,利用互聯(lián)網(wǎng)資源對(duì)β3Gn-T8基因mRNA序列設(shè)計(jì)三條可能的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),通過(guò)RNAi-mate介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入人胃癌細(xì)胞AGS中,設(shè)計(jì)梯度轉(zhuǎn)染體系,以最高轉(zhuǎn)染效率和最低細(xì)胞死亡率為原則,優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染.AGS細(xì)胞的條件。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞,采用H-E染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,RT-PCR.,Real time-PCR法檢測(cè)β3Gn-T8基因

3、在轉(zhuǎn)錄水平的改變；western blot檢測(cè)β3 Gn-T8在蛋白水平的改變。確定最有效的siRNA序列。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258檢測(cè)AGS細(xì)胞凋亡,MTT。比色法檢測(cè)有效siRNA對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響。
　　 2.從β3GnT家族和β3GalT家族中篩選出與β3GnT-8有較高同源性的基因。通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出與該同源基因有相互作用的與癌癥浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因,并預(yù)測(cè)β3Gn-T8與這些基因的作用。

4、>　　 3.轉(zhuǎn)染有效β3GnT8 siRNA和pEGFP-C1-β13Gn-T8正義真核表達(dá)載體,檢測(cè)與癌癥浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因mRNA水平和蛋白水平表達(dá),明膠酶譜法測(cè)酶活,Transwell法檢測(cè).AGS細(xì)胞侵襲能力變化。將隨機(jī)分成control組,siRNA組,pEGFP-C1-β3Gn-T8-sense組的裸鼠分別給予皮下接種以構(gòu)建人胃癌細(xì)胞AGS異種裸鼠成瘤,在動(dòng)物實(shí)體水平深入研究。
　　 結(jié)果:
　　 1.化學(xué)合

5、成三條siRNA分子轉(zhuǎn)染人AGS細(xì)胞株,綜合最高轉(zhuǎn)染效率與最低細(xì)胞死亡率的優(yōu)化原則,最終選擇每1×105個(gè)細(xì)胞100 nmol/L作為轉(zhuǎn)染siRNA的實(shí)驗(yàn)濃度,并篩選出其中一條對(duì)β3Gn-T8基因抑制效率最高的siRNA序列。檢測(cè)出轉(zhuǎn)染了該有效siRNA的細(xì)胞中β3Gn-T8的mRNA和蛋白表達(dá)都受到了有效抑制,同時(shí)也引起AGS細(xì)胞凋亡,細(xì)胞增值受到抑制。
　　 2.經(jīng)過(guò)同源性比對(duì),β3Gn-T2與β3Gn-T8有較大同源性。從

6、數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出和β3Gn-T2有相互作用的與癌癥浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)β3Gn-T2與MMP-2,TIMP-2具有很密切的相互作用,分析作用通路,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子ETS-1,Jun在其中起重要的調(diào)控作用。分析β3Gn-T8上游調(diào)控序列,找出轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)現(xiàn)β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)ETS-1和五個(gè)Jun結(jié)合位點(diǎn),猜測(cè)β3GnT8與MMP-2,TIMP-2之間也存在一定的調(diào)控作用。
　　 3.分析了β3Gn-

7、T8和胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系:轉(zhuǎn)染有效的siRNA后,MMP-2mRNA和蛋白表達(dá)均受到抑制,而TIMP-2的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均有所升高；明膠酶譜法檢測(cè)出MMP2活性降低,細(xì)胞侵襲能力降低。轉(zhuǎn)染正義β3Gn-T8表達(dá)載體后,MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)均升高,而TIMP-2的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均降低；明膠酶譜法檢測(cè)出MMP2活性升高,細(xì)胞侵襲能力提高。接種siRNA組的裸鼠成瘤時(shí)間明顯延長(zhǎng),成瘤率為100％,腫瘤體積和重量明顯小于接

8、種AGS組的裸鼠(P＜0.01)；接種pEGFP-C1-β3Gn-T8-sense組的裸鼠成瘤時(shí)間明顯縮短,成瘤率為100％,腫瘤體積和重量明顯大于接種AGS組的裸鼠(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:采用生物信息學(xué)的方法設(shè)計(jì)出有效siRNA靶位點(diǎn)；siRNA能有效抑制AGS細(xì)胞中β3Gn-T8基因的表達(dá),抑制細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí),β3Gn-T8與MMP-2,TIMP-2的表達(dá)及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力有一定的相關(guān)性,更深入的機(jī)制