胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)功能基因的研究.pdf

1、胃癌是全球最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居腫瘤的第四位和第二位。全世界每年約有90萬胃癌新發(fā)患者，同時(shí)約有70萬人死于胃癌。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均居第二位，明顯高于世界平均水平。多年來胃癌治療后的五年生存率一直低于24％。導(dǎo)致胃癌高死亡率的重要原因是胃癌經(jīng)常發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，治療后又易于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，尋找和研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子和功能性基因，從而獲得能用于靶向治療轉(zhuǎn)移性胃癌及胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子靶標(biāo)的功能性基因。同時(shí)

2、也望能獲得檢測預(yù)示胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志物，為胃癌的臨床個(gè)體化治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　 本研究針對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能，首先采用體外Matrigel侵襲克隆篩選技術(shù)，建立了體外高侵襲能力的胃癌亞細(xì)胞系SNU5-P3和PAMC82-P3。通過全基因組芯片比較SNU5-P3和PAMC82-P3與其親本細(xì)胞的基因表達(dá)譜，獲得了38個(gè)在兩張芯片共同上調(diào)表達(dá)的差異基因，其中16/38(42％)已報(bào)道是與侵襲轉(zhuǎn)移功能相關(guān)的基因。LO

3、XL2是一個(gè)在兩張芯片共同上調(diào)表達(dá)的基因，通過生物信息學(xué)分析和細(xì)胞表達(dá)譜分析，表明LOXL2可能是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的功能基因。WesternBlot檢測結(jié)果顯示LOXL2在6種高侵襲的胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯地高于侵襲能力弱的3種胃癌細(xì)胞系。在514例組織標(biāo)本中，通過免疫組化檢測LOXL2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在正常組織、胃癌組織以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的組化染色評(píng)分分別為0.43、1.47及1.87，提示LOXL2在正常組織、胃癌組織以及轉(zhuǎn)移淋

4、巴結(jié)逐級(jí)上調(diào)表達(dá)。此外分析發(fā)現(xiàn)LOXL2在胃癌原發(fā)灶的表達(dá)與胃癌的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良密切相關(guān)(P<0.001)，通過COX多因素分析提示LOXL2是一個(gè)獨(dú)立于腫瘤侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有價(jià)值的預(yù)后因子。因此，我們較系統(tǒng)探討研究了該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能及其相應(yīng)的分子機(jī)制。RNA干擾研究結(jié)果顯示該基因的靜默能夠在體外顯著抑制胃癌細(xì)胞PAMC82-P3和BGC823的侵襲能力分別達(dá)51.7％和53.5％，體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型研究顯示RN

5、A干擾該基因的表達(dá)對胃癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有明顯的抑制作用，抑制率達(dá)90％。外源基因轉(zhuǎn)染低侵襲能力的胃癌細(xì)胞系N87后，轉(zhuǎn)染后的N87細(xì)胞在體外的侵襲能力增加約2.5倍。這些研究結(jié)果表明LOXL2基因在體內(nèi)外都能明顯地促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。體外利用LOXL2抗體及人重組蛋白處理胃癌細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)分泌型的LOXL2能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲(P<0.01)、與基質(zhì)的粘附(P<0.01)，并且這種抑制作用具有劑量依賴關(guān)系。分子機(jī)制研究表明分泌

6、型的LOXL2能夠氧化細(xì)胞外底物產(chǎn)生過量的過氧化氫，進(jìn)而激活Src-FAK信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。針對分泌型的LOXL2，我們制備了LOXL2兔多抗，通過體內(nèi)抗體治療實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LOXL2抗體能夠有效地抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其對自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的抑制率高達(dá)99％，提示分泌型的LOXL2是一個(gè)治療胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的有潛力的分子靶標(biāo)。這些關(guān)于LOXL2在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能及其分子機(jī)制的研究，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 尋找胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相

7、關(guān)基因及分子有利于篩選獲得能夠預(yù)示胃癌轉(zhuǎn)移、胃癌分期及預(yù)后的相關(guān)分子標(biāo)志物，為臨床實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療胃癌及胃癌轉(zhuǎn)移提供重要的科學(xué)依據(jù)。我們針對上面38個(gè)在兩張侵襲芯片中共同上調(diào)表達(dá)的差異基因，通過表達(dá)譜分析和生物信息學(xué)分析選取了4個(gè)基因作預(yù)示胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的候選標(biāo)志物。在238例具有完整預(yù)后臨床資料的胃癌標(biāo)本中通過免疫組化檢測這四個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，S100A14和LGASL1的表達(dá)與胃癌病人的TNM分期以及預(yù)后不良密切相關(guān)(P<0.

8、01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)S100A14和LGASL1的表達(dá)與pNO胃癌的預(yù)后密切相關(guān)(logranktest，P<0.01)。隨后通過邏輯回歸分析和leave-one-out檢測分析這些標(biāo)志物預(yù)測胃癌pNO期病人術(shù)后5年是否死亡的敏感性和特異性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，LGALS1單獨(dú)預(yù)測的敏感性是68.7％，特異性是78.9％:S100A14單獨(dú)預(yù)測的敏感性是79.7％，特異性是74.5％；此外，我們還發(fā)現(xiàn)T分期參數(shù)預(yù)測胃癌pNO期病人術(shù)后5年內(nèi)