胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選暨AEG-1與胃癌預(yù)后關(guān)系的研究.pdf

1、第一章胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選
　　 目的：
　　 篩選胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并對(duì)興趣基因進(jìn)行驗(yàn)證，探討胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制；并研究淋巴管來(lái)源的CXCL1在胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法：
　　 胃癌SGC7901(5×106)細(xì)胞注射于裸大鼠爪墊，建立胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。移植瘤周?chē)⑸銭van's藍(lán)，顯示胭窩淋巴結(jié)(前哨淋巴結(jié))和其輸入淋巴管。分離前哨淋巴結(jié)的輸入淋巴管。原代培養(yǎng)淋巴管內(nèi)

2、皮細(xì)胞，采用間接法磁珠分選，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)分離的細(xì)胞純度，免疫組織化學(xué)(VEGFR-3、LYVE-1、podoplanin)鑒定細(xì)胞。胭窩淋巴結(jié)連續(xù)切片，HE(hematoxylin and eosin)染色確定是否腫瘤轉(zhuǎn)移。收集胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到前哨淋巴結(jié)后培養(yǎng)的輸入淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，Agilent基因表達(dá)譜芯片篩選與對(duì)照淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的差異表達(dá)基因。利用軟件篩選差異表達(dá)基因，RT-PCR方法對(duì)基因芯片的有關(guān)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　

3、 我們挑選上調(diào)表達(dá)的CXCL1作為興趣基因。觀察CXCL1對(duì)SGC7901細(xì)胞的趨化作用，研究CXCL1的受體CXCR2在SGC7901細(xì)胞和125例胃癌組織中的表達(dá)情況，分析CXCR2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和淋巴管密度(lymphatic vesselsdensity，LVD)之間的關(guān)系。體外建立淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，觀察淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞CXCL1的表達(dá)情況和調(diào)節(jié)的機(jī)制。研究共培養(yǎng)后淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成能

4、力的變化，并觀察CXCL1siRNA及CXCR2受體阻斷劑SB225002對(duì)共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和小管形成能力的影響，并分析參與分子的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 胃癌爪墊裸大鼠移植瘤成功。原位瘤早期(2周)顯微手術(shù)成功分離前哨淋巴結(jié)的輸入淋巴管。貼壁培養(yǎng)的淋巴管周?chē)莱錾掀蛹?xì)胞，間接法磁珠分選LYVE+的細(xì)胞，流式細(xì)胞學(xué)證實(shí)分選的LYVE+細(xì)胞比例95％以上。LYVE-1、podoplanin、VGFR-3免疫細(xì)胞

5、化學(xué)染色結(jié)果顯示所培養(yǎng)的為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。Agilent芯片雜交結(jié)果熒光信號(hào)強(qiáng)度較一致，實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定，芯片平均檢出率(即有表達(dá)的基因)70.74％。根據(jù)差異倍數(shù)大于2并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)篩選了846個(gè)差異表達(dá)的基因，其中457個(gè)上調(diào)，389個(gè)下調(diào)。RT-PCR檢測(cè)Timp2、EphrinB1、FoxC2、Igfbp3、SMAD7、CXCL1、Oldlr1、Agt和Lrp3基因表達(dá)趨勢(shì)，和芯片結(jié)果符合。根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及

6、潛在與淋巴管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，挑選了一系列相關(guān)的基因：趨化和生長(zhǎng)因子、脈管發(fā)生和模式、脈管壓力、細(xì)胞粘附和類(lèi)固醇合成等。包含至少四個(gè)差異基因且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路包括：過(guò)氧化物酶增殖體激活受體、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞因子和受體作用、補(bǔ)體與凝集的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)受體以及細(xì)胞間隙連接、Wnt信號(hào)途徑、黏著斑激酶信號(hào)途徑、類(lèi)固醇合成途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、胰島素信號(hào)途徑。
　　 芯片結(jié)果提示CXCL1基因上調(diào)表達(dá)3.3倍，RT

7、-PCR結(jié)果提示升高6.2倍。我們發(fā)現(xiàn)CXCL1因子對(duì)SGC7901細(xì)胞有趨化作用。CXCL1受體CXCR2在SGC7901細(xì)胞上呈陽(yáng)性表達(dá)，而在125例胃癌組織中，其中80例CXCR2呈陽(yáng)性表達(dá)。其表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外CXCR2的表達(dá)與LVD相關(guān)。體外建立共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的CXCL1表達(dá)上調(diào)，而且CXCL1表達(dá)上調(diào)與NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位有關(guān)。CXCL1表達(dá)上調(diào)后淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管

8、形成能力增強(qiáng)。CXCL1siRNA及CXCR2受體阻斷劑SB225002可以阻斷這種變化。CXCL1表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成能力增強(qiáng)與p-FAK(Tyr-397)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-Rho A(Ser-188)蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)，CXCL1siRNA及CXCR2受體阻斷劑SB225002可以下調(diào)共培養(yǎng)的LECs的p-FAK(Tyr-397)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)

9、、p-Rho A(Ser-188)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了前哨淋巴結(jié)的輸入淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移后的差異基因表達(dá)譜。篩選了一系列與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和淋巴管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)的基因和信號(hào)通路。
　　 CXCL1/CXCR2在胃癌淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。CXCL1促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移，其受體CXCR2在胃癌組織中表達(dá)與LVD密切相關(guān)。淋巴管來(lái)源的CXCL1在促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮

10、重要作用。
　　 第二章 AEG-1與胃癌預(yù)后關(guān)系的研究
　　 目的：
　　 研究星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與預(yù)后的關(guān)系；探討AEG-1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及遷移、侵襲的影響及其機(jī)制；初步探討抑制AEG-1表達(dá)胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)的敏感性的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 We

11、stern blot檢測(cè)AEG-1在胃癌細(xì)胞(AGS，SGC7901，MGC803，MKN28和MKN45)中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)105例胃癌組織及其中對(duì)應(yīng)30例癌旁組織AEG-1的表達(dá)情況。結(jié)合臨床和隨訪資料，分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。生存分析采用Kaplan-Meier法。單因素采用x2檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型。
　　 采用RT-PCR方法篩選特異抑制AEG-1表達(dá)的siRNA，Western blot檢

12、測(cè)其抑制效果。觀察AEG-1下調(diào)后對(duì)胃癌SGC7901生物學(xué)行為的影響。MTT檢測(cè)生長(zhǎng)，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室觀察細(xì)胞的遷移和侵襲。Westernbolt檢測(cè)AEG-1下調(diào)后胃癌Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。觀察Wnt信號(hào)通路激活劑氯化鋰對(duì)AEG-1 siRNA處理后β-catenin表達(dá)的影響。
　　 觀察AEG-1 siRNA對(duì)SGC7901細(xì)胞5-Fu的耐藥曲線和半數(shù)抑制濃度(IC5

13、0)的影響，RT-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞AEG-1siRNA處理后5-Fu代謝的關(guān)鍵酶-二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 AEG-1在五種胃癌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中在低分化的胃腺癌細(xì)胞株(SGC7901和MKN45)中的表達(dá)高于在高分化或者中等分化的癌細(xì)胞株的表達(dá)(AGS、MGC803和MKN28)。在我們105例病人標(biāo)本中，66例(62.

14、9％)胃癌組織呈陽(yáng)性表達(dá)。AEG-1的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期明顯相關(guān)(P值分別為0.000，0.004，0.026和0.000)。AEG-1的表達(dá)與Ki-67增殖指數(shù)相關(guān)。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)AEG-1過(guò)表達(dá)與胃癌預(yù)后明顯相關(guān)，AEG-1高表達(dá)的患者的五年的生存率為28.78％，中位生存期為23個(gè)月，而AEG-1表達(dá)陰性的生存率為61.5％，中位生存期為38個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。單因素分

15、析其他因子T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期與胃癌的預(yù)后相關(guān)。Cox模型中發(fā)現(xiàn)，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和AEG-1過(guò)表達(dá)是胃癌獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　 si-002對(duì)AEG-1表達(dá)的抑制效應(yīng)最強(qiáng)。AEG-1下調(diào)可以抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)，胃癌細(xì)胞的早期凋亡比例增加。AEG-1siRNA處理細(xì)胞能明顯抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。AEG-1siRNA能下調(diào)p-AKT(S473)、p-GSK3β(S9)、β-cateni

16、n、Lef-1和cyclinD1的表達(dá)。AEG-1siRNA明顯抑制氯化鋰刺激的β-catenin的表達(dá)。
　　 轉(zhuǎn)染 AEG-1 siRNA的SGC7901細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及僅轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，細(xì)胞耐藥性明顯降低，IC50值明顯下降(P＜0.05)。SGC7901細(xì)胞表達(dá)一定量的DPDmRNA，而且經(jīng)5-Fu處理后，表達(dá)水平升高。AEG-1 siRNA可以下調(diào)DPDmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論：