DNA條形碼鑒定中藥材和中成藥的應(yīng)用研究.pdf

1、DNA條形碼技術(shù)作為新興的分子生物學(xué)鑒定手段，受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前已經(jīng)作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，被列入《中國(guó)藥典》2015版。DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)有10多年的應(yīng)用，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定的不足，作為傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充。本文以藏菖蒲、四季青、菟絲子，含人參、川貝母的中成藥為例，基于通用的ITS2序列，對(duì)DNA條形碼技術(shù)在中藥材鑒定中的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而應(yīng)用于中藥材和中成藥市場(chǎng)監(jiān)管的流程方法進(jìn)行探究。得出以下結(jié)論

2、:
　　(1)根莖類藥材——藏菖蒲的鑒定:以47份藏菖蒲及其近緣種和混偽品的ITS2序列和從GenBank中獲得的49條ITS2序列作為研究對(duì)象，進(jìn)行分析。通過(guò)序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、查找SNP位點(diǎn)、分析變異位點(diǎn)等方法，發(fā)現(xiàn)第23位和212位存在穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)，可準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲。NJ樹顯示，藏菖蒲可以準(zhǔn)確的與混偽品和菖蒲屬其他物種進(jìn)行區(qū)分。DNA條形碼技術(shù)結(jié)合SNP可用于鑒定藏菖蒲及其近緣種和混偽品。
　　(2)葉片類藥

3、材——四季青的鑒定:以四季青及其近緣種和混偽品的37份植物樣本為實(shí)驗(yàn)材料，依照標(biāo)準(zhǔn)流程獲取DNA并測(cè)序。進(jìn)而結(jié)合GenBank中獲得28條四季青的同屬近緣種以及混偽品女貞、四川山礬的ITS2序列對(duì)冬青種間種內(nèi)序列進(jìn)行分析，構(gòu)建鄰接樹。冬青從各個(gè)方面均能與同屬其他物種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。所以DNA條形碼可以有效地把四季青與其形態(tài)相似的混偽品和近緣種進(jìn)行區(qū)分。作為一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的分子生物學(xué)鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)可以應(yīng)用于四季青及其近緣種

4、和混偽品的鑒定，同時(shí)對(duì)于準(zhǔn)確鑒定冬青屬物種亦有巨大潛力。
　　(3)種子類藥材——菟絲子的鑒定:基于菟絲子及其近緣種共45份實(shí)驗(yàn)樣本的207條ITS2序列構(gòu)建菟絲子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合克隆測(cè)序，對(duì)33份購(gòu)自藥店、醫(yī)院和藥材市場(chǎng)的菟絲子藥材進(jìn)行鑒定。構(gòu)建鄰接樹，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定效率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)69.7％的市售菟絲子藥材均存在混偽現(xiàn)象，僅有10份菟絲子藥材為正品?；靷挝锓N主要包括綠穗莧、埃塞俄比亞芥、

5、大頭菜、藜、中亞蟲實(shí)、Cuscuta alata、日本菟絲子、單柱菟絲子、茴香、大豆、紫苜蓿等11種。結(jié)果表明本研究所用的方法對(duì)菟絲子鑒定和市場(chǎng)監(jiān)管都有很好的效果。
　　(4)中成藥的鑒定:以人參健脾丸、人參歸脾丸、蛇膽川貝膠囊、啟脾丸為4種含有名貴中藥材的中成藥作為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序?qū)χ谐伤幩煞值腎TS2序列和300 bp短序列進(jìn)行測(cè)序和分析。結(jié)果表明，四種中成藥中均檢測(cè)到了正品中藥材的近緣種，甚至于本應(yīng)含有人參的中成