DNA分子標(biāo)記在中藥材鑒定中的應(yīng)用研究.pdf

1、本文探索使用多重位點(diǎn)特異引物PCR和ISSR-PCR方法鑒定中藥材近緣混淆品種及多來源品種，并對(duì)各種PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了特異、穩(wěn)定、快捷的中藥材分子鑒定新方法。本論文主要分以下三方面內(nèi)容： 一、中藥材DNA提取方法的探討本次研究選取具有代表性的含淀粉、多糖較多的人參、西洋參、半夏、天花粉藥材，在常規(guī)CTAB法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，將提取緩沖液中NaCl濃度提高到2.5mol·L-1，有效地去除了淀粉和其他多糖；延長溫育時(shí)間至

2、2h，不使用液氮研磨樣品，提取緩沖液配方中省去巰基乙醇、PVP等成分；用高純水溶解DNA沉淀；提取步驟為：溫育、氯仿萃取、沉淀；使操作簡化從而降低中藥材DNA提取難度。 二、中藥材位點(diǎn)特異性PCR方法鑒別本文建立了多重位點(diǎn)特異性PCR方法鑒別中藥材人參、西洋參。應(yīng)用人參鑒別引物PgS481F和PgS712R和西洋參引物PgS481F和PqtK896F，對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)反應(yīng)體系優(yōu)化，依據(jù)各自的特異條帶進(jìn)行鑒別。結(jié)果當(dāng)

3、退火溫度為66℃時(shí)，出現(xiàn)249bp條帶的為人參，1049bp條帶的為西洋參。并使用20個(gè)不同來源的人參、西洋參樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。該法能在同一次PCR反應(yīng)中準(zhǔn)確地鑒別人參、西洋參。多重位點(diǎn)特異性PCR方法用于中藥分子鑒定。使用該法經(jīng)一次PCR反應(yīng)成功地鑒別了人參與西洋參，半夏及其混淆品，虎掌南星及其混淆品，動(dòng)物類藥材虎骨、豹骨及其混淆品。位點(diǎn)特異性PCR方法鑒別半夏及其混淆品。應(yīng)用半夏鑒別引物PtITSF和PtITSR對(duì)半夏5個(gè)產(chǎn)地的新鮮

4、樣品、10個(gè)產(chǎn)地的藥材以及5批虎掌、水半夏樣品進(jìn)行PCR檢測。當(dāng)退火溫度為62℃時(shí)，只有半夏正品能夠擴(kuò)增395bp條帶，所有混淆品無擴(kuò)增。 應(yīng)用虎掌南星鑒別引物Pprp1148F和Pprp1480R，當(dāng)退火溫度為65℃時(shí)，僅有虎掌南星擴(kuò)增351bp條帶，其它混淆品無擴(kuò)增。 應(yīng)用虎骨鑒別引物PtCytbF和PtCybR對(duì)4個(gè)虎骨、10個(gè)豹骨及各自的混淆品進(jìn)行鑒定。當(dāng)退火溫度為52℃時(shí)，只有虎骨在326bp擴(kuò)增條帶，混淆品無

5、擴(kuò)增。豹骨鑒別引物Pp3F和Pp3R對(duì)樣品擴(kuò)增，當(dāng)退火溫度為59℃時(shí)，只有豹骨出現(xiàn)374bp條帶，混淆品無擴(kuò)增。 三、多來源中藥材ISSR-PCR方法鑒別本次研究對(duì)藥典多來源藥材的鑒別做了初步的探索研究。應(yīng)用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增方法鑒別三來源甘草、兩來源黃芪、三來源大黃。實(shí)驗(yàn)中對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過對(duì)40個(gè)ISSR引物的篩選，當(dāng)退火溫度為55℃時(shí)，引物UBC826可以鑒別三來源甘草；引物UBC866可以鑒別

6、兩來源黃芪；引物UBC818可對(duì)三來源大黃進(jìn)行鑒定。 通過本次研究得到如下結(jié)論：1.針對(duì)藥材干品鑒定中的難點(diǎn)，使用改進(jìn)CTAB方法成功地從含淀粉、多糖類的典型藥材人參、西洋參、半夏、天花粉中提取到基因組DNA，所得DNA提取液純度高，得率增加，完全滿足下游PCR實(shí)驗(yàn)的要求，將中藥材DNA提取步驟簡化。 2.利用第三代分子標(biāo)記-單核苷酸多態(tài)性(SNP位點(diǎn))，建立多重位點(diǎn)特異性PCR方法鑒定中藥材。使用人參、西洋參各自的特異

7、性鑒別引物，經(jīng)一次PCR反應(yīng)成功地將二者鑒定。并且驗(yàn)證了該P(yáng)CR反應(yīng)適用于不同產(chǎn)地人參、西洋參的藥材、飲片、標(biāo)本的鑒定。方法的特異性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。 3.同時(shí)應(yīng)用位點(diǎn)特異PCR方法成功地鑒定了中藥材半夏及其混淆品，虎掌南星及其混淆品，動(dòng)物藥材虎骨、豹骨及其混淆品。其中對(duì)于名貴的動(dòng)物類藥材虎骨、豹骨為首次利用分子標(biāo)記方法進(jìn)行鑒定。為今后缺乏特征性理化成分及以器官組織入藥的動(dòng)物類藥材的鑒定奠定了基礎(chǔ)。 4.利用簡單重復(fù)