皮質(zhì)酮通過Mfn2介導(dǎo)線粒體損傷對雞胚心臟發(fā)育的影響.pdf

1、流行病學(xué)研究表明，胎兒時期不良的宮內(nèi)環(huán)境會導(dǎo)致成年期高血壓、心臟肥大、胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）、2型糖尿病和精神心理障礙等一系列疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。孕婦產(chǎn)前應(yīng)激狀態(tài)下，大量分泌的皮質(zhì)激素（Corticosteroides），能夠直接或間接通過胎盤屏障進(jìn)入宮內(nèi)影響胚胎發(fā)育。近年來更有大量的動物試驗(yàn)及臨床研究表明，妊娠期過度的糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid,GC）暴露與胎兒生長受限、成年期心血管及內(nèi)分泌

2、代謝等系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中對于心臟的副作用更是包括了短期和長期的影響，因此成為目前研究的關(guān)注點(diǎn)之一。然而，關(guān)于類固醇皮質(zhì)激素對胚胎心臟發(fā)育的影響及損傷機(jī)制尚未深入闡明。同時，考慮到目前用于研究產(chǎn)前皮質(zhì)類激素暴露對胚胎發(fā)育影響過程中胎生動物模型存在胚胎內(nèi)環(huán)境無法接觸的局限性。因此，本課題將分別采用雞胚模型觀察應(yīng)激激素皮質(zhì)酮（Corticosterone,CORT）對胚胎心臟發(fā)育的影響，并結(jié)合CORT負(fù)荷H9C2細(xì)胞模型研究和

3、探討其內(nèi)在的分子機(jī)理。
　　首先，我們建立 CORT負(fù)荷誘導(dǎo)心臟發(fā)育障礙的雞胚模型。通過向EDD3（Embryo development day3）雞胚氣室隔天注射一系列濃度的CORT（0.5、2.5、5、10nmol/egg），模擬胚胎生長的高皮質(zhì)類激素暴露環(huán)境，繼續(xù)孵育至EDD14結(jié)束。為確定外源性注射的CORT能夠進(jìn)入胚胎體內(nèi)影響心臟發(fā)育，我們通過HPLC-UV方法檢測胚胎血漿中CORT的含量，并對胚體及心臟進(jìn)行稱重，統(tǒng)計(jì)心

4、臟的相對重量、死亡率等指標(biāo)。體視鏡下觀察胚胎心臟的外部形態(tài)特征并拍照，經(jīng)固定、包埋、切片及H&E病理染色觀察胚胎心臟的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源性注射的CORT能夠被雞胚吸收，血漿中CORT水平顯著上升，導(dǎo)致胚胎死亡率增加、生長發(fā)育遲緩、而心臟相對重量卻顯著上升，且一定范圍內(nèi)與CORT濃度呈劑量相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上我們選擇了CORT2.5nmol和5nmol進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，CORT負(fù)荷雞胚胎的心臟整體體積增大并伴隨有心

5、室腔擴(kuò)大、室壁變薄，室壁心肌細(xì)胞密度降低、間距增大等內(nèi)部形態(tài)特征，同時進(jìn)一步麥胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）染色結(jié)果顯示單個心肌細(xì)胞橫截面積明顯增大。為進(jìn)一步觀察CORT對心臟病理學(xué)變化的影響，通過超聲心動圖（Echocardiography）評價其心臟功能狀況，檢測結(jié)果顯示CORT導(dǎo)致胚胎心臟收縮功能下降，表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率顯著下降。通過免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)CORT負(fù)荷能夠抑制心肌細(xì)胞的增

6、殖、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時增加心臟肌球蛋白的表達(dá)。RT-PCR檢測結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CORT作用后心臟肌動蛋白（Actinαcardiac muscle l,ACTC-1）的mRNA水平顯著升高。以上結(jié)果提示，CORT能夠抑制心肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)凋亡，刺激細(xì)胞向肥大表型轉(zhuǎn)變，造成心臟異常肥大，收縮功能降低。
　　基于心臟組織代謝活躍、能量需求高、線粒體含量豐富等特點(diǎn)，臨床上一系列心臟疾病的發(fā)生發(fā)展均與線粒體代謝功能異常息息相關(guān)。相

7、關(guān)研究表明，線粒體功能異常被認(rèn)為是促進(jìn)心肌病理肥大變化及向心衰轉(zhuǎn)變的主要發(fā)病機(jī)理之一。為此，本課題進(jìn)一步研究了CORT對雞胚心肌組織中線粒體功能的影響。向EDD3雞胚氣室隔天注射CORT（2.5和5nmol）后，孵育至EDD14取雞胚心臟組織，使用線粒體分離試劑盒提取心肌細(xì)胞線粒體，采用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位ψm及通過熒光酶標(biāo)儀實(shí)時監(jiān)測線粒體內(nèi)ROS的生成速率，HPLC法測定肥大心肌組織中能量物質(zhì)ATP含量變化。此外，利用試劑盒分別

8、對心肌組織內(nèi)氧化和抗氧化能力指標(biāo)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，CORT負(fù)荷能夠顯著影響雞胚心肌細(xì)胞的線粒體功能，具體表現(xiàn)為ψm下降、ROS產(chǎn)生速率增加、ATP含量顯著下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加而抗氧化酶MnSOD活性和抗氧化分子GSH/GSSG相對量卻顯著降低。同時，CORT負(fù)荷也會導(dǎo)致雞胚心肌細(xì)胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性III、IV、V顯著下降。此外，通過透射電鏡我們還觀察到雞胚注射CORT后，心肌細(xì)胞中的線粒體

9、出現(xiàn)聚集呈簇等異?，F(xiàn)象。以上結(jié)果提示，CORT負(fù)荷會導(dǎo)致雞胚心肌細(xì)胞中線粒體形態(tài)及功能異常。
　　線粒體融合蛋白2（Mitofusin2,Mfn2）蛋白是一種介導(dǎo)線粒體融合的重要蛋白，參與維持線粒體動力學(xué)平衡及結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)。近期有研究在嚙齒類動物應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激產(chǎn)生的激素CORT能夠通過調(diào)控Mfn2表達(dá)而影響腦組織的線粒體結(jié)構(gòu)及功能。因此，我們猜想CORT負(fù)荷導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育紊亂且伴隨線粒體功能障礙是否涉及Mfn2的表達(dá)異常。利用

10、Western Blotting檢測雞胚心肌組織Mfn2蛋白表達(dá)變化，結(jié)果表明，CORT負(fù)荷組雞胚心肌組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平較對照組明顯上調(diào)。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證CORT引起心肌細(xì)胞肥大確實(shí)是與Mfn2介導(dǎo)的線粒體功能缺陷有關(guān)，本課題采用CORT（200μM，48h）負(fù)荷大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2建立體外模型，實(shí)驗(yàn)分為Control、CORT以及CORT+GR拮抗劑（Ru486）三組，觀察CORT對H9C2細(xì)胞形態(tài)的影響，Mfn

11、2蛋白水平以及線粒體膜電位的變化，同時通過Western Blotting檢測細(xì)胞水平凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。最后在單獨(dú)轉(zhuǎn)染過表達(dá)Mfn2蛋白情況下，檢測其對心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及凋亡的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證CORT導(dǎo)致心臟肥大發(fā)育異常是通過調(diào)控Mfn2而實(shí)現(xiàn)的。結(jié)果顯示，H9C2細(xì)胞經(jīng)CORT作用后，出現(xiàn)與雞胚實(shí)驗(yàn)相同的結(jié)果，CORT能夠?qū)е滦募〖?xì)胞體積變大，細(xì)胞水平Mfn2蛋白表達(dá)上調(diào)，線粒體膜電位ψm降低以及Bcl-2蛋白家族Bax/Bcl-2

12、相對水平增加，心肌細(xì)胞凋亡增加。在提前給予GR拮抗劑（Ru486,10μM）基礎(chǔ)上再經(jīng)CORT作用，上述變化均可得到相應(yīng)的改善，提示CORT可能通過GR介導(dǎo)以上心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及凋亡的改變。同時在轉(zhuǎn)染過表達(dá)Mfn2后，凋亡蛋白Bax/Bcl-2顯著增加，活化的Caspase3蛋白表達(dá)增多以及心肌細(xì)胞肥大基因SKA的mRNA水平上升，說明CORT可通過調(diào)控Mfn2表達(dá)進(jìn)而損傷線粒體、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，致使心室壁細(xì)胞數(shù)目減少，最終引起心臟發(fā)育損傷、