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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
通過(guò)沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的Mfn2(Mitochondria fusin-2)基因,觀察其對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響,并探討其作用機(jī)制是否與MMP-2(Matzix metalloproteinase2)相關(guān),為將Mfn2基因作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。
方法用Western blot方法比較弱侵襲力乳腺癌細(xì)胞 MCF-7和強(qiáng)侵襲力乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中Mfn2的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)
2、針對(duì)Mfn2基因的siRNA,利用轉(zhuǎn)染試劑-脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹Mfn2-siRNA,將其導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞MCF-7中,以沉默目的基因 Mfn2(實(shí)驗(yàn)組),同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列組)和空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)。用帶熒光染料的陰性對(duì)照組摸索最佳轉(zhuǎn)染條件。采用qRT-PCR(real-time fluorescent quantitative,PCR)方法在RNA水平上檢測(cè)Mfn2基因沉默效果。分別用免疫細(xì)胞
3、化學(xué)和Western blot方法檢測(cè)Mfn2的表達(dá)水平。采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分析比較三組中MCF-7細(xì)胞的侵襲力和遷移力的異同。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法,在蛋白水平上檢測(cè)三組細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)量。
結(jié)果弱侵襲力細(xì)胞MCF-7中Mfn2表達(dá)水平高于強(qiáng)侵襲力細(xì)胞MDA-MB-231,兩組間有顯著性差異(P<0.05)。利用帶熒光染料的陰性對(duì)照序列找到最佳轉(zhuǎn)染條件,轉(zhuǎn)染試劑為2μl的FAM-
4、siRNA對(duì)應(yīng)1μl的Lipofectamine2000,轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)85%;應(yīng)用qRT-PCR法結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組,陰性對(duì)照組,空白對(duì)照組中Mfn2的mRNA的相對(duì)水平分別是(0.27±0.03),(0.97±0.01),(1.00±0.00);實(shí)驗(yàn)組中 Mfn2的mRNA水平低于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2074.682,P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中目的基因 Mfn2的沉默效率可高達(dá)75%。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果經(jīng)IPP軟件分析顯示:實(shí)
5、驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組 Mfn2蛋白的表達(dá)水平分別為(335331.67±7216.089)、(637438.67±30060.641)和(673956.67±25132.255);實(shí)驗(yàn)組的Mfn2蛋白水平低于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=138.831,P<0.05);兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中 Mfn2的相對(duì)表達(dá)水平(OD, relative
6、 optical density)分別為(0.474019±0.0059504)、(1.144936±0.0256883)和(1.093283±0.0584572);實(shí)驗(yàn)組Mfn2的表達(dá)量低于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.312,P<0.05);兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示,siRNA有效沉默了 MCF-7細(xì)胞內(nèi) Mfn2基因,導(dǎo)致其mRNA和蛋白水平顯著降低。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:劃痕24h后,實(shí)驗(yàn)組、陰性
7、對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移率分別為(0.1774±0.0065)%、(0.0715±0.0053)%和(0.0649±0.0046)%;實(shí)驗(yàn)組的24h細(xì)胞遷移率高于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=392.782,P<0.05);兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。劃痕48h后,實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移率分別為(0.3200±0.0100)%、(0.1162±0.0054)%和(0.0660±0.0037)%;實(shí)驗(yàn)組
8、的48h細(xì)胞遷移率高于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1141.329,P<0.05);兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的侵出小室細(xì)胞數(shù)分別為(900.330±50.501)、(440.000±26.458)和(460.000±20.000);實(shí)驗(yàn)組侵出小室細(xì)胞數(shù)高于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=166.916,P<0.05),兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)
9、。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中 MMP-2蛋白的表達(dá)水平分別為(630055.33±26745.600)、(432000.00±8544.044)和(437837.68±5860.727);實(shí)驗(yàn)組的MMP-2蛋白水平高于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1291.687,P<0.05);兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中 MMP-2的相對(duì)
10、值(OD)分別為(1.0067±0.00452)、(0.4507±0.01867)和(0.4334±0.01736)。實(shí)驗(yàn)組 MMP-2的表達(dá)量高于兩對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.832,P<0.05);兩對(duì)照組間MMP-2表達(dá)量無(wú)顯著差別(P>0.05)。
結(jié)論:
1.Mfn2基因表達(dá)水平的降低可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞MCF-7的侵襲、遷移能力增強(qiáng)。
2.Mfn2基因可能通過(guò)調(diào)控MMP-2的表達(dá)影響MCF-
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