microRNA98靶向N-RAS調(diào)控涎腺腺樣囊性癌惡性生物學(xué)行為的研究.pdf

1、目的：
　　探討 miR-98在涎腺腺樣囊性癌組織和癌旁組織、高/低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)差異及其對腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，通過生物信息學(xué)軟件尋找miR-98的潛在靶基因并初步探討 miR-98參與調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的作用機(jī)理。
　　方法：
　　1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及其對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響：通過real-time PCR檢測3例新鮮涎腺腺樣囊性癌組織以及癌旁正常組織、高

2、轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-M以及低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-83中miR-98的表達(dá)水平。采用lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-98mimics使miR-98過表達(dá)，并通過RT-PCR驗證。通過MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化，劃痕實驗、趨化運動實驗檢測遷移能力變化，Transwell檢測侵襲能力變化，Western blotting檢測遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　2、miR-98靶向N-RAS通

3、過RAS信號通路調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的作用機(jī)理：采用生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar、miRbase等對miR-98潛在的靶基因結(jié)合位點進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)N-RAS基因mRNA的3，非翻譯區(qū)中多個軟件預(yù)測的共同結(jié)合位點區(qū)域。構(gòu)建包含結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告基因載體WT-NRAS-PGL3-control及突變型的熒光素酶報告基因載體MUT-NRAS-PGL3-control。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C N-RAS是 miR

4、-98的靶基因。miR-98mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)高miR-98的表達(dá)水平后，Western blotting以及免疫熒光技術(shù)檢測N-RAS的表達(dá)變化， Western blotting檢測N-RAS蛋白的表達(dá)變化以及下游MAPK/ERK信號通路中ERK、p-ERK和PI3K/AKT信號通路中AKT、p-AKT的表達(dá)變化。收集我院涎腺腺樣囊性癌石蠟標(biāo)本43例及臨床病理資料，免疫組織化學(xué)檢測涎腺腺樣囊性癌石蠟標(biāo)本中N-RAS的表達(dá)情況，并

5、與臨床病理因素行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌組織和高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系 SACC-83，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以 ACC-M作為細(xì)胞模型，轉(zhuǎn)染miR-98 mimics調(diào)高miR-98的表達(dá)水平；MTT結(jié)果顯示miR-98過表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力受到抑制；平板克隆實驗結(jié)果顯示細(xì)胞的克隆形成率下降；流式細(xì)胞術(shù)提示S期的細(xì)胞明顯減少，而G0/G1期的細(xì)胞明顯增

6、多，表明細(xì)胞被阻滯在G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程中；劃痕閉合延遲、趨化實驗穿膜細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞的遷移能力下降；Transwell小室穿過基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞的侵襲能力下降；Western blotting檢測遷移相關(guān)蛋白，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin的表達(dá)下調(diào)。
　　2、生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar、miRbase分析結(jié)果顯示N-RAS是miR-98的靶基因之一，3個

7、靶基因數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果顯示的其結(jié)合位點均含有位于N-RAS基因3，端的186-192的堿基序列。miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后48h，RT-PCR驗證miR-98在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平上調(diào)；Western blotting結(jié)果顯示miR-98過表達(dá)后N-RAS蛋白的表達(dá)水平下降；免疫熒光結(jié)果顯示 N-RAS的表達(dá)定位于細(xì)胞漿，miR-98過表達(dá)后胞漿的熒光信號減弱。雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR-98能夠顯著抑制野生型報告基因載體 W

8、T-NRAS-PGL3-control的熒光素酶活性，而對突變型報告基因載體MUT-NRAS-PGL3-control的熒光素酶活性沒有影響。miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后48h，提取總蛋白，Western blotting結(jié)果顯示miR-98過表達(dá)后MAPK/ERK信號通路中ERK蛋白的表達(dá)水平不變，而p-ERK蛋白的表達(dá)水平下調(diào)；PI3K/AKT信號通路中AKT蛋白的表達(dá)水平不變，而p-AKT蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。N-RAS在涎腺腺

9、樣囊性癌組織中主要在胞漿中呈陽性表達(dá),其陽性表達(dá)率為83.7％(36/43), N-RAS的表達(dá)水平與臨床分期、腫瘤大小相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、組織分型、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌中呈低表達(dá)狀態(tài)。miR-98通過阻滯細(xì)胞周期中G0/G1期向 S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，抑制涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖能力，并且抑制 ACC-M細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　2、N-RAS是miR-9