高通量抗IAV藥物篩選模型的構建及檳榔堿抗IAV誘導的炎癥損傷藥效藥理學研究.pdf

1、甲型流感病毒（IAV）作為全球嚴重的傳染病之一，一直威脅著人類健康，20世紀以來的多次大流行已造成數(shù)千萬人死亡，多數(shù)患者死于IAV誘導的急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。Nox2 NADPH氧化酶是IAV誘導肺上皮細胞產生過量活性氧（ROS）造成肺損傷的重要因素，Nrf2/ARE信號通路是細胞氧化應激的關鍵通路。本文基于Nox2 NADPH氧化酶和抗氧化反應元件（ARE）構建高通量藥物篩選模型，用于抗IAV藥物的篩選

2、，并對篩選出的藥物進行藥效藥理機制研究。
　　基于p47phox與p22phox兩亞基相互作用是Nox2 NADPH氧化酶活化的關鍵，本文構建了Nox2雙分子熒光互補相關質粒（SH3/p47phox-pMC、p22phox-pMN）；同時，利用p47phox、p67phox及 ARE啟動子序列構建了NCF1、NCF2、ARE啟動子熒光素酶報告基因質粒，建立多種細胞水平的藥物篩選平臺。在上述模型中，ARE-luc比較成熟，可用于后續(xù)

3、藥物篩選工作。
　　用ARE-luc模型對134種中藥粗提物進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)青蒿、當歸、葛根、白花蛇舌草、檳榔堿均能顯著促進ARE轉錄，其中檳榔堿活性為空白對照的4.72倍。體外實驗，利用空斑試驗檢測檳榔粗提物（ANE）及檳榔堿的抗IAV活性；體內實驗，滴鼻感染6周齡Balb/c小鼠建立小鼠肺炎模型，進行檳榔堿藥效藥理分析，包括：感染第4天小鼠肺組織病毒滴度、炎癥因子、超氧化物水平、病理損傷程度及相應通道蛋白水平的檢測，及持續(xù)2

4、周的體重變化和生存率分析。
　　體外抗IAV試驗顯示，ANE可顯著抑制PR8增殖，但檳榔堿對PR8復制無明顯抑制作用。體內實驗，檳榔堿能一定程度減輕肺組織水腫程度，改善病理損傷，極顯著（P<0.01）促進IL-10轉錄，促進HO-1表達，減緩感染小鼠的體重下降，提高生存率。但檳榔堿對TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA的變化及JNK1、Akt、p38MAPK、Erk1/2的磷酸化水平無顯著影響（P>0.05）。
　　由于

5、毒性作用，檳榔被WHO列為一級致癌物，為此我們研究了ANE的致口腔黏膜成纖維細胞纖維化效應及人工牛黃（CB）對它的拮抗效應。體外實驗，用ANE誘導口腔黏膜成纖維細胞異常增長模型，進行CB的藥效學研究。結果顯示，CB可明顯抗ANE的細胞毒作用。
　　總之，我們成功建立了ARE-luc藥物篩選模型，并發(fā)現(xiàn)ANE良好的抗IAV潛能，檳榔堿在抗IAV誘導的ALI方面也體現(xiàn)出一定的效果。另，CB能有效拮抗ANE的毒副作用，為檳榔堿的進一步開