嗜熱菌分子分類(lèi)方法及適應(yīng)性機(jī)制的初步研究.pdf

1、微生物是地球上最大的生物資源寶庫(kù)，嗜熱微生物作為其一個(gè)重要的組成部分，由于生長(zhǎng)環(huán)境的極端特殊性，使得它們具有了一套獨(dú)特的酶系統(tǒng)和防御機(jī)制來(lái)適應(yīng)這種對(duì)大多數(shù)生物來(lái)說(shuō)是難以生存的環(huán)境。它們細(xì)胞和酶蛋白獨(dú)特的耐熱性和與之相適應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，使之成為了人們開(kāi)發(fā)利用的重要生物資源，從中分離和提取的新穎工業(yè)酶和其他生物活性物質(zhì)在基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程及礦產(chǎn)資源的開(kāi)發(fā)利用上均有很大的應(yīng)用價(jià)值。更為重要的是，嗜熱微生物在生物系統(tǒng)進(jìn)化中具有特殊地位

2、，蘊(yùn)涵著生命進(jìn)化歷程的豐富信息，對(duì)其環(huán)境適應(yīng)性機(jī)理等生理特征的研究，將對(duì)研究生命的起源，進(jìn)而揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)具有重要的意義。 本文從廈門(mén)周邊地區(qū)溫泉采集得到樣品，在75℃和80℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)并分離得到60株嗜熱菌。由于傳統(tǒng)上微生物主要依靠培養(yǎng)和生化等表型特征進(jìn)行分類(lèi)鑒定，較為煩瑣。為了從大量的菌株中篩選出不同的菌株，有效的簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，我們運(yùn)用了細(xì)菌全蛋白SDS-PAGE電泳比較分析、RAPD比較分析和16S-23SrDN

3、A間隔區(qū)比較分析等分子生物學(xué)方法從中篩選得到7株種屬不同的嗜熱菌，并進(jìn)一步運(yùn)用16SrDNA序列分析鑒定其種屬關(guān)系，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 由于嗜熱菌的最適生長(zhǎng)溫度比較高，因此其對(duì)環(huán)境溫度變化的適應(yīng)性不僅對(duì)其生存、生長(zhǎng)至觀重要，而且對(duì)于研究其與常溫菌等其他微生物的關(guān)系，進(jìn)而解開(kāi)生命進(jìn)化之謎具有重要意義。在篩選得到的菌株中，我們選取了WH-10作為進(jìn)一步的研究對(duì)象，運(yùn)用隨機(jī)引物PCR技術(shù)(Randomarbitrarilypri

4、medPCR，RAP-PCR)，以最適生長(zhǎng)溫度(75℃)作對(duì)照，研究WH-10在最低生長(zhǎng)溫度(45℃)下基因表達(dá)的差異。通過(guò)對(duì)RAP-PCR優(yōu)化，差異基因篩選的陽(yáng)性率得到了極大地提高。在篩選到的53個(gè)差異片段中，我們選取了35個(gè)差異片段進(jìn)一步用Northernblot進(jìn)行驗(yàn)證，其中有18個(gè)差異基因證實(shí)在轉(zhuǎn)錄水平上存在著表達(dá)差異。這些基因主要涉及細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的改變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及生理代謝的適應(yīng)性調(diào)整，比較全面的反映了嗜熱微生物對(duì)低溫環(huán)境整

5、體的適應(yīng)性，將有助于闡明嗜熱微生物對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性機(jī)制。 在篩選到的棲熱菌屬(Thermus)的菌株中，我們分離到了其所攜帶的質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定我們得到contig243、contig245、contig265和contig458等4個(gè)DNA片段。在進(jìn)一步的序列分析、PCR擴(kuò)增以及Southernblot驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，初步判定該菌攜帶有兩個(gè)質(zhì)粒，contig265組成pS4C，而contig243、contig245

6、和contig458組成pL4C。通過(guò)對(duì)所得序列基因功能的預(yù)測(cè)，除了維持質(zhì)粒自身復(fù)制所需要的replicationprotein外，在質(zhì)粒上編碼最多的基因是與DNA修復(fù)相關(guān)的基因(如DNAG：T-mismatchrepairendonuclease、C-5cytosine-specificDNAmethylase等)，另外，在質(zhì)粒上還編碼有transposase和integrase等遺傳重組基因。進(jìn)一步的測(cè)序分析將使我們獲得質(zhì)粒全序列，