深海超嗜熱嗜壓古菌Pyrococcus yayanosii壓力適應(yīng)性機(jī)制研究.pdf

1、深海是典型的高靜水壓環(huán)境,嗜壓微生物(piezophile)是深海生態(tài)系統(tǒng)中的重要類群。隨著深海取樣技術(shù)的不斷發(fā)展和深海高壓微生物特殊培養(yǎng)裝置的研發(fā),已經(jīng)從深海環(huán)境中分離到了多種嗜壓微生物,其中包括不能在常壓條件下生長的專性嗜壓微生物。通過對分布于不同壓力范圍的微生物近緣種間進(jìn)行比較而獲得的嗜壓微生物的壓力適應(yīng)性的認(rèn)識,不能反映微生物個體水平上對靜水壓力變化的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制。本文通過比較嚴(yán)格嗜壓菌株與其衍生的兼性嗜壓菌株在基因組、轉(zhuǎn)錄組及

2、相關(guān)生理性狀上的差異,試圖從微生物細(xì)胞的物質(zhì)代謝與能量轉(zhuǎn)化的角度分析深海嗜壓微生物的壓力適應(yīng)性。
　　Pyrococcusyayanosii CH1分離自大西洋中脊4100米水深的“Ashadze”熱液口,是目前已知的第一株和唯一一株嚴(yán)格嗜壓的超嗜熱古菌,其最適生長壓力為52 MPa,最高耐受壓力超過了120 MPa。本論文通過人工馴化手段,獲得CH1衍生的兼性嗜壓菌株A1,其最適生長壓力為52 MPa,但壓力耐受范圍變寬,可以在

3、0.1 MPa的常壓條件下生長。對A1菌株進(jìn)行全基因組測序,并與CH1進(jìn)行比較基因組分析,結(jié)果表明兩個基因組中存在23處序列差異,這些序列差異所在的基因主要與細(xì)胞周期調(diào)控、鞭毛的合成以及芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)。對A1菌株中相關(guān)基因的功能展開研究,將有助于揭示此類深海超嗜熱嗜壓古菌的壓力適應(yīng)性機(jī)制。
　　A1可以在常壓下生長,使以該菌株為宿主建立遺傳操作系統(tǒng)成為可能。構(gòu)建了攜帶A1中pyrF基因側(cè)翼同源序列和受谷氨酸脫氫酶強(qiáng)啟動子

4、控制的3-hydroxy-3-methylglutaryl輔酶 A(HMG-CoA)還原酶超表達(dá)基因元件(SimR)的自殺質(zhì)粒pLMO02。利用過表達(dá)HMG-CoA還原酶賦予A1菌株simvastatin抗性作為標(biāo)記,成功的中斷了A1菌株的pyrF基因(PYCH0296),獲得了尿嘧啶缺陷型菌株A2。而且,又構(gòu)建了SimR-pyrF基因元件,獲得了無痕基因中斷載體pLMO03。無痕敲除系統(tǒng)突破了A1菌株中可用篩選標(biāo)記的限制,可以中斷A1

5、基因組中的任何非必需基因,并且篩選標(biāo)記可以重復(fù)利用。
　　單一菌株以甲酸為唯一碳源的產(chǎn)氫呼吸途徑僅見于深海超嗜熱古菌Thermococcus onnurineus NA1,是最簡單的厭氧呼吸方式之一。比較基因組分析表明,Thermococcales科超嗜熱古菌中只有 Thermococcus onnurineus NA1、Thermococcus gammatolerans EJ3和Pyrococcusyayanosii中存在有完

6、整的甲酸代謝基因簇(Fmr)。中斷A1菌株的Fmr基因簇后,突變株中大量積累甲酸,其0.1 MPa的生長也受到限制。膜結(jié)合態(tài)氫酶復(fù)合體 Mbh以及胞質(zhì)內(nèi)氫酶復(fù)合體SHI參與了Thermococcales微生物的能量代謝,中斷A1菌株的Mbh和SHI基因簇后,突變株中也積累甲酸,表明Mbh和SHI復(fù)合體也參與了A1菌株的甲酸代謝。
　　甲酸既是代謝過程中的重要中間代謝產(chǎn)物,也是一些超嗜熱微生物肌苷(IMP)合成途徑中的一碳單元。對A

7、1菌株在0.1 MPa和52 MPa壓力條件下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),與IMP合成途徑相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄在0.1 MPa壓力條件下調(diào),而與甲酸代謝及能量轉(zhuǎn)換相關(guān)的氫酶的編碼基因則轉(zhuǎn)錄上調(diào)。該結(jié)果暗示,A1中參與IMP合成代謝的甲酸被分解產(chǎn)能以適應(yīng)低壓的脅迫環(huán)境。而對于CH1在15 MPa和52 MPa壓力條件下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),其在15 MPa的邊界壓力下,不能有效的調(diào)節(jié)甲酸由參與IMP合成向氧化產(chǎn)能轉(zhuǎn)換。
　　進(jìn)一步對 IMP合成途徑和甲

8、酸氧化途徑相關(guān)基因的啟動子區(qū)域分析,發(fā)現(xiàn)IMP生物合成途徑中的多個基因的上游區(qū)域,存在有一個保守的 motif“CnTn5TGn3AAA”。以此 motif為探針,通過磁珠富集的方法獲得了可以與該motif結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(PTF)。轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析結(jié)果表明,A1菌株中甲酸代謝受壓力調(diào)控的可能模型為:當(dāng)A1處于52 MPa時,PTF高表達(dá),并與IMP途徑中相關(guān)基因的motif結(jié)合,激活I(lǐng)MP途徑的表達(dá)。甲酸作為一碳單元,參與IMP的合成