鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)及其分子機(jī)制.pdf

1、細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)是指細(xì)胞受到低劑量的電離輻射或環(huán)境化學(xué)毒素處理后,會(huì)對(duì)隨后的大劑量攻擊性處理產(chǎn)生耐受性,減輕攻擊劑量引起的損傷。人們對(duì)低劑量電離輻射所誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)已開展了大量研究,獲得了一些重要的發(fā)現(xiàn),部分掌握了輻射適應(yīng)性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。然而,在物理化學(xué)因素誘導(dǎo)的細(xì)胞交叉適應(yīng)性反應(yīng)方面尚缺乏足夠的信息。除電離輻射外,環(huán)境中還存在許多由于人類活動(dòng)所產(chǎn)生的化學(xué)污染物,是危害人類健康的重要因素,而不同物理化學(xué)因子之間則可能具有交叉適應(yīng)性或協(xié)

2、同增強(qiáng)作用,在評(píng)價(jià)環(huán)境因子對(duì)人類健康的影響時(shí)必須綜合考慮物理化學(xué)因子的聯(lián)合暴露。作為一種具有廣泛工業(yè)應(yīng)用的重金屬,鎘同時(shí)也是一種常見的環(huán)境毒物,在環(huán)境巾的半衰期長(zhǎng)達(dá)15.20年,這使得鎘成為環(huán)境毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)。因此,研究鎘誘導(dǎo)的交叉適應(yīng)性及其作用機(jī)制將有助于我們深入了解環(huán)境物理化學(xué)因子影響人類健康的分子機(jī)制,為正確評(píng)價(jià)環(huán)境因子對(duì)人類健康的影響、重建環(huán)境因子的致癌危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)新模式提供理論支持。
　　本論文首先以具有不同DNA修復(fù)能

3、力的三株同源倉(cāng)鼠卵巢母細(xì)胞為對(duì)象,采用不同劑量的氯化鎘(CdCl2)和γ-射線,以微核形成率為檢測(cè)指標(biāo),研究鎘誘導(dǎo)三株細(xì)胞系對(duì)大劑量鎘和電離輻射產(chǎn)生交叉適應(yīng)性反應(yīng)的程度,探討DNA修復(fù)能力、預(yù)處理劑量和攻擊劑量對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的影響。研究ATM和H2S是否參與鎘誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng),探索這兩種信號(hào)分子在適應(yīng)性反應(yīng)中的作用,為研究鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞交叉適應(yīng)性反應(yīng)的分予機(jī)制奠定基礎(chǔ)。其次,采用人類肝細(xì)胞進(jìn)一步研究了鎘誘導(dǎo)下細(xì)胞對(duì)電離輻射交叉適應(yīng)性反應(yīng)

4、的分子機(jī)制,檢測(cè)外源性H2S供體NaHS和內(nèi)源性H2S合成酶抑制劑對(duì)該適應(yīng)性反應(yīng)的影響,檢測(cè)胞內(nèi)活性氧水平的變化以及內(nèi)源性H2S合成酶CSE和CBS的表達(dá)情況,探討H2S及其內(nèi)源性合成關(guān)鍵酶在鎘誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)中的作用。最后,采用western blot和real-time PCR的方法,研究H2S與ATM、NF-κB以及p-P53之間的關(guān)系,探討H2S參與鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的分子機(jī)制。
　　通過對(duì)CHO細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn):低濃

5、度鎘能夠誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)隨后高濃度鎘處理或高劑量輻射產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。經(jīng)1μMCdCl2預(yù)處理,間隔2h,再給予50μMCdCl2的攻擊性處理,三株細(xì)胞均能表達(dá)十分顯著的適應(yīng)性反應(yīng)(p＜0.01),CHO-9、EM-C11、XR-C1三株細(xì)胞的微核率比直接攻擊處理組分別降低52％,40％和52％,顯示EM-C11細(xì)胞的適應(yīng)性程度低于另外兩株細(xì)胞。當(dāng)攻擊劑量升至100μM時(shí),1μMCdCl2預(yù)處理僅能誘導(dǎo)CHO-9細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),而EM-C1

6、1和XR-C1細(xì)胞無顯著適應(yīng)性反應(yīng)。對(duì)于交叉適應(yīng)性試驗(yàn),當(dāng)攻擊劑量為1Gy時(shí),0.1和1μMCdCl2預(yù)處理都能夠誘導(dǎo)三株細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng);但當(dāng)攻擊劑量提高至2Gy時(shí),0.1μMCdCl2的預(yù)處理僅能誘導(dǎo)CHO-9細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng);而1μMCdCl2預(yù)處理則可誘導(dǎo)CHO-9和EM-C11細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),但兩株細(xì)胞的適應(yīng)性程度不同,,CHO-9和EM-C11的微核率與攻擊處理組相比分別降低22％(p＜0.01)和12％(p＜0.0

7、5)。對(duì)于XR-C1細(xì)胞,兩個(gè)預(yù)處理劑量都無法誘導(dǎo)其對(duì)2Gy攻擊劑量照射產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。此外,采用PI-3K的抑制劑wortmannin,ATM的抑制劑KU-55933以及合成內(nèi)源性H2S的抑制劑PPG后,鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)均消失,而外源性H2S能夠直接誘導(dǎo)CHO-9細(xì)胞產(chǎn)生輻射適應(yīng)性反應(yīng)。
　　在人肝細(xì)胞系中進(jìn)行的研究結(jié)果顯示:鎘也能在人類細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),且在同樣的預(yù)處理和攻擊處理?xiàng)l件下,低濃度鎘可以增加正常人肝細(xì)

8、胞對(duì)隨后高劑量輻射的耐受性,但對(duì)肝癌細(xì)胞HepaG2所受的輻射損傷無保護(hù)作用,提示該反應(yīng)產(chǎn)生與否可能與細(xì)胞的惡性程度有關(guān)。此外,ATM同樣參與了肝細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的誘導(dǎo),抑制磷酸化ATM的表達(dá)后,Chang氏肝細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)消失。
　　近年來,H2S已被證實(shí)是CO和NO以外的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。本文研究結(jié)果顯示,50μMNaHS預(yù)處理可以使得受到2Gyγ-射線照射Chang氏細(xì)胞的微核率降低32.65％,產(chǎn)生顯著的適應(yīng)性反應(yīng)

9、(p＜0.01),并且該適應(yīng)性反應(yīng)的程度與NaHS的濃度有關(guān),75μMNaHS預(yù)處理可使得受照射細(xì)胞的微核率降低44.85％,表現(xiàn)出更高程度的適應(yīng)性反應(yīng)。內(nèi)源性H2S是由磷酸吡哆醛-5'-磷酸依賴性酶包括CBS和CSE催化含硫氨基酸所產(chǎn)生的,肝細(xì)胞中CSE和CBS均有表達(dá)。但H2S合成酶CSE受到PPG抑制后,Chang氏細(xì)胞的適應(yīng)性也隨后消失,而抑制另一個(gè)內(nèi)源性H2S合成酶CBS則對(duì)鎘誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)無影響。因此,作為內(nèi)源性信號(hào)因子,

10、H2S參與了鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)。
　　檢測(cè)不同處理后胞內(nèi)ROS水平發(fā)現(xiàn),50、75、100μMH2S單獨(dú)處理細(xì)胞的ROS水平均有所增高,但僅50μM處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)細(xì)胞受2Gy輻射后,胞內(nèi)ROS水平上升明顯,比空白對(duì)照增加2.5倍;當(dāng)用H2S預(yù)處理細(xì)胞4h后再給予細(xì)胞2Gy照射,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ROS水平較對(duì)照也有所上升,ROS分別增加60％,74％和75％,但顯著低于直接照射組水平,僅為其50％左右(p＜0.01)。說明H

11、2S預(yù)處理顯著降低了輻射誘導(dǎo)的ROS水平。
　　Westemblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明,CSE而非CBS的表達(dá)與細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)密切相關(guān)。單純2Gy照射和1μMCdCl2處理均上調(diào)了CSE的表達(dá),且具有時(shí)間依賴性,在處理后12h表達(dá)分別上調(diào)81％和134％;此外,對(duì)于鎘誘導(dǎo)發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)的細(xì)胞,其CSE表達(dá)也較直接照射組增加一倍左右(p＜0.01)。但電離輻射和鎘處理均未改變細(xì)胞CBS的表達(dá)。
　　進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究表明,高劑量

12、輻射能夠激活并上調(diào)ATM激酶和P53蛋白的表達(dá),NF-κB的活性也明顯增加。在鎘誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的過程中,H2S與這些信號(hào)分子之間可能存在有相互作用。與直接照射組比較,外源性H2S預(yù)處理可降低輻照后即時(shí)ATM磷酸化水平,而CSE抑制劑PPG預(yù)處理則增強(qiáng)了ATM磷酸化水平。但隨著輻照后時(shí)間的延長(zhǎng),這兩種預(yù)處理對(duì)磷酸化ATM表達(dá)的變化均無影響。Westemblot和real-timePCR的結(jié)果均顯示,ATM抑制劑對(duì)輻照后CSE蛋白和

13、mRNA的表達(dá)均無顯著影響。與單純照射組相比,外源性H2S預(yù)處理可使得P53磷酸化水平降低50％(P＜0.01),而PPG則不改變P53磷酸化水平的表達(dá)。此外,外源性H2S處理還可降低輻射誘導(dǎo)的活性NF-κB水平(p＜0.05),說明H2S對(duì)輻照后NF-κB的激活起負(fù)調(diào)控作用。
　　概括而言,本論文的研究表明,低劑量鎘能夠誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)隨后攻擊性物理化學(xué)因子表達(dá)適應(yīng)性或交叉適應(yīng)性反應(yīng),無種屬特異性,并且該反應(yīng)的產(chǎn)生不依賴于細(xì)胞的DNA

14、損傷修復(fù)能力,但細(xì)胞適應(yīng)性程度的大小與DNA損傷修復(fù)能力、預(yù)處理和攻擊處理劑量相關(guān);相對(duì)于DSB,SSB或堿基切除修復(fù)(BER)可能在鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性中起主要作用。ATM信號(hào)通路是鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的主要信號(hào)通路之一;新型氣體信號(hào)分子H2S通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS水平參與鎘誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng),而CSE的表達(dá)上調(diào)在鎘誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)中起主要作用,但CSE的表達(dá)并不依賴于ATM的激活,H2S/CSE途徑對(duì)輻射誘導(dǎo)的ATM及P53磷酸化以及NF