PTEN調(diào)節(jié)的ERK5信號對PC12細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景：神經(jīng)細(xì)胞再生與分化障礙或退化涉及到許多疾病如老年癡呆、脊髓性肌肉萎縮、亨廷頓舞蹈癥等，PTEN和MAPKs信號在細(xì)胞生長與分化過程中起著正負(fù)調(diào)節(jié)的作用，決定著生存與凋亡、生長與分化間的平衡。作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，PTEN是一個重要的磷酸酶也是一個重要的腫瘤抑制因子。自從PTEN在1997年作為一個抑癌基因發(fā)現(xiàn)后，人們對其生物學(xué)活性進(jìn)行了非常廣泛的研究。已知PTEN的一個最重要的活性在于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生長與增殖信號，抑制過強(qiáng)信號導(dǎo)致

2、的細(xì)胞惡性增生，在信號的正負(fù)平衡方面，起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用. PTEN不僅對磷脂具有去磷酸化活性，使IP3去磷酸化生成PIP2，抑制PI3K/AKT信號通路的活性。而且對蛋白質(zhì)也具有去磷酸化作用，已有研究分析表明，PTEN去磷酸化的底物氨基酸殘基既包括絲氨酸和蘇氨酸也包括酪氨酸。最早發(fā)現(xiàn)的PTEN蛋白質(zhì)底物是FAK（focal adhesion kinase）。因而，PTEN又被稱為雙性磷酸酶。與PTEN對細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)陰性調(diào)節(jié)相對應(yīng)，MA

3、PK家族在促進(jìn)細(xì)胞生長方面屬于陽性調(diào)控，在經(jīng)典MAPK中，ERK5發(fā)現(xiàn)較晚、分子量相對較大，又稱為BMK1，其由816個氨基酸構(gòu)成，位于氨基末端近一半氨基酸殘基構(gòu)成了激酶結(jié)構(gòu)域，其羧基末端包括兩個脯氨酸富集區(qū)、一個核定位信號和一個近末端的自動磷酸化區(qū)域。ERK5信號途徑受應(yīng)激信號、生長因子和細(xì)胞因子信號激活。功能范圍主要涉及細(xì)胞的生長、分化和調(diào)亡。ERK5受MEKK2/3-MEK5級聯(lián)激活，激活后的ERK5轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，直接激活其他轉(zhuǎn)錄因

4、子。因此，PTEN在細(xì)胞內(nèi)可能有著廣泛的底物，可能直接或間接調(diào)節(jié)ERK5的活性。而PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株，膜上有NGF受體，受生理水平NGF誘導(dǎo)后，它們停止分裂，長出突起，分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞，常用于神經(jīng)系統(tǒng)的體外研究。因此，通過本課題的研究，我們可能在PTEN對ERK5途徑的各組分間對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控中以及對神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)現(xiàn)新的治療靶位點，對臨床應(yīng)用具有很大的意義。
　　目的：通過比較確

5、定PTEN作用于Cot/Tpl-MEKK2/3—MEK5—ERK5信號通路的切入點，即PTEN通過哪個分子的去磷酸化，下調(diào)這一信號通路的活性。而后，實驗將進(jìn)一步確定PTEN與靶目標(biāo)分子間的作用，再利用免疫共沉淀、GST-pulldown重點分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、PTEN與MEK5、PTEN與ERK5間的相互作用，確定PTEN調(diào)節(jié)ERK5信號通路的切入點以及PTEN沉默后對PC12細(xì)胞分化的影響。
　　方法

6、：利用免疫共沉淀重點分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、MEK5和ERK5間的相互作用，通過比較確定PTEN作用于Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號通路的切入點；利用慢病毒穩(wěn)定感染技術(shù)，通過免疫印記（Western-blot）驗證并檢測PTEN過表達(dá)后和沉默后，上、下游各信號分子磷酸化水平的變化，確定PTEN通過去磷酸化哪個分子來下調(diào)這一信號通路的活性；再通過體外實驗，原核誘導(dǎo)表達(dá)GST-PTEN，然后

7、GST-pulldown PC12細(xì)胞裂解液，驗證 PTEN作用的靶蛋白，以期確定 PTEN調(diào)節(jié)Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號通路對PC12細(xì)胞分化的影響；此外，利用RayBio人類RTK磷酸化抗體芯片，檢測PTEN過表達(dá)和沉默后受體酪氨酸激酶信號通路各因子的相對磷酸化水平，檢測PTEN可能作用的靶蛋白受體，探索可能受PTEN去磷酸化調(diào)控的與細(xì)胞分化相關(guān)的其他信號通路分子。
　　結(jié)果：在獲得PTEN穩(wěn)定過表

8、達(dá)和沉默的HEK293T細(xì)胞系后，通過Western-blot、免疫共沉淀及 GST-pulldown發(fā)現(xiàn)，PTEN沉默后，MEK5和ERK5的磷酸化水平增加，且PTEN能與MEK5、ERK5相互作用；通過計數(shù)得到的細(xì)胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)是PTEN沉默后HEK293T細(xì)胞生長速度比PTEN過表達(dá)的細(xì)胞生長速度快；通過培養(yǎng)PTEN沉默的PC12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)相對于正常的PC12突起生長顯著；通過RayBiotech人類受體酪氨酸激酶磷酸化抗體芯片

9、1檢測，發(fā)現(xiàn)PTEN沉默后，與PTEN沉默對照組相比，有四個因子EphB3、HGFR、MUSK、VEGFR2磷酸化水平上調(diào)，PTEN沉默后與PTEN過表達(dá)相比，有兩個因子Insulin R和VEGFR2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：⑴PTEN通過作用于MEK5間接調(diào)節(jié)ERK5活性，并同時直接作用于ERK5調(diào)節(jié)Cot/Tpl-MEKK2/3-MEK5-ERK5信號通路；⑵PTEN沉默后，能夠促進(jìn)HEK293T細(xì)胞的增殖；⑶PTEN