2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩86頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、背景:神經(jīng)細(xì)胞再生與分化障礙或退化涉及到許多疾病如老年癡呆、脊髓性肌肉萎縮、亨廷頓舞蹈癥等,PTEN和MAPKs信號(hào)在細(xì)胞生長(zhǎng)與分化過(guò)程中起著正負(fù)調(diào)節(jié)的作用,決定著生存與凋亡、生長(zhǎng)與分化間的平衡。作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子,PTEN是一個(gè)重要的磷酸酶也是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子。自從PTEN在1997年作為一個(gè)抑癌基因發(fā)現(xiàn)后,人們對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了非常廣泛的研究。已知PTEN的一個(gè)最重要的活性在于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)與增殖信號(hào),抑制過(guò)強(qiáng)信號(hào)導(dǎo)致

2、的細(xì)胞惡性增生,在信號(hào)的正負(fù)平衡方面,起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用. PTEN不僅對(duì)磷脂具有去磷酸化活性,使IP3去磷酸化生成PIP2,抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。而且對(duì)蛋白質(zhì)也具有去磷酸化作用,已有研究分析表明,PTEN去磷酸化的底物氨基酸殘基既包括絲氨酸和蘇氨酸也包括酪氨酸。最早發(fā)現(xiàn)的PTEN蛋白質(zhì)底物是FAK(focal adhesion kinase)。因而,PTEN又被稱(chēng)為雙性磷酸酶。與PTEN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)陰性調(diào)節(jié)相對(duì)應(yīng),MA

3、PK家族在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)方面屬于陽(yáng)性調(diào)控,在經(jīng)典MAPK中,ERK5發(fā)現(xiàn)較晚、分子量相對(duì)較大,又稱(chēng)為BMK1,其由816個(gè)氨基酸構(gòu)成,位于氨基末端近一半氨基酸殘基構(gòu)成了激酶結(jié)構(gòu)域,其羧基末端包括兩個(gè)脯氨酸富集區(qū)、一個(gè)核定位信號(hào)和一個(gè)近末端的自動(dòng)磷酸化區(qū)域。ERK5信號(hào)途徑受應(yīng)激信號(hào)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子信號(hào)激活。功能范圍主要涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和調(diào)亡。ERK5受MEKK2/3-MEK5級(jí)聯(lián)激活,激活后的ERK5轉(zhuǎn)位到核內(nèi),直接激活其他轉(zhuǎn)錄因

4、子。因此,PTEN在細(xì)胞內(nèi)可能有著廣泛的底物,可能直接或間接調(diào)節(jié)ERK5的活性。而PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株,膜上有NGF受體,受生理水平NGF誘導(dǎo)后,它們停止分裂,長(zhǎng)出突起,分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞,常用于神經(jīng)系統(tǒng)的體外研究。因此,通過(guò)本課題的研究,我們可能在PTEN對(duì)ERK5途徑的各組分間對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控中以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)現(xiàn)新的治療靶位點(diǎn),對(duì)臨床應(yīng)用具有很大的意義。
  目的:通過(guò)比較確

5、定PTEN作用于Cot/Tpl-MEKK2/3—MEK5—ERK5信號(hào)通路的切入點(diǎn),即PTEN通過(guò)哪個(gè)分子的去磷酸化,下調(diào)這一信號(hào)通路的活性。而后,實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步確定PTEN與靶目標(biāo)分子間的作用,再利用免疫共沉淀、GST-pulldown重點(diǎn)分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、PTEN與MEK5、PTEN與ERK5間的相互作用,確定PTEN調(diào)節(jié)ERK5信號(hào)通路的切入點(diǎn)以及PTEN沉默后對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響。
  方法

6、:利用免疫共沉淀重點(diǎn)分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、MEK5和ERK5間的相互作用,通過(guò)比較確定PTEN作用于Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號(hào)通路的切入點(diǎn);利用慢病毒穩(wěn)定感染技術(shù),通過(guò)免疫印記(Western-blot)驗(yàn)證并檢測(cè)PTEN過(guò)表達(dá)后和沉默后,上、下游各信號(hào)分子磷酸化水平的變化,確定PTEN通過(guò)去磷酸化哪個(gè)分子來(lái)下調(diào)這一信號(hào)通路的活性;再通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),原核誘導(dǎo)表達(dá)GST-PTEN,然后

7、GST-pulldown PC12細(xì)胞裂解液,驗(yàn)證 PTEN作用的靶蛋白,以期確定 PTEN調(diào)節(jié)Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號(hào)通路對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響;此外,利用RayBio人類(lèi)RTK磷酸化抗體芯片,檢測(cè)PTEN過(guò)表達(dá)和沉默后受體酪氨酸激酶信號(hào)通路各因子的相對(duì)磷酸化水平,檢測(cè)PTEN可能作用的靶蛋白受體,探索可能受PTEN去磷酸化調(diào)控的與細(xì)胞分化相關(guān)的其他信號(hào)通路分子。
  結(jié)果:在獲得PTEN穩(wěn)定過(guò)表

8、達(dá)和沉默的HEK293T細(xì)胞系后,通過(guò)Western-blot、免疫共沉淀及 GST-pulldown發(fā)現(xiàn),PTEN沉默后,MEK5和ERK5的磷酸化水平增加,且PTEN能與MEK5、ERK5相互作用;通過(guò)計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)是PTEN沉默后HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)速度比PTEN過(guò)表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快;通過(guò)培養(yǎng)PTEN沉默的PC12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常的PC12突起生長(zhǎng)顯著;通過(guò)RayBiotech人類(lèi)受體酪氨酸激酶磷酸化抗體芯片

9、1檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PTEN沉默后,與PTEN沉默對(duì)照組相比,有四個(gè)因子EphB3、HGFR、MUSK、VEGFR2磷酸化水平上調(diào),PTEN沉默后與PTEN過(guò)表達(dá)相比,有兩個(gè)因子Insulin R和VEGFR2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
  結(jié)論:⑴PTEN通過(guò)作用于MEK5間接調(diào)節(jié)ERK5活性,并同時(shí)直接作用于ERK5調(diào)節(jié)Cot/Tpl-MEKK2/3-MEK5-ERK5信號(hào)通路;⑵PTEN沉默后,能夠促進(jìn)HEK293T細(xì)胞的增殖;⑶PTEN

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論