PTEN調(diào)節(jié)的ERK5信號(hào)對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景：神經(jīng)細(xì)胞再生與分化障礙或退化涉及到許多疾病如老年癡呆、脊髓性肌肉萎縮、亨廷頓舞蹈癥等，PTEN和MAPKs信號(hào)在細(xì)胞生長(zhǎng)與分化過(guò)程中起著正負(fù)調(diào)節(jié)的作用，決定著生存與凋亡、生長(zhǎng)與分化間的平衡。作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，PTEN是一個(gè)重要的磷酸酶也是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子。自從PTEN在1997年作為一個(gè)抑癌基因發(fā)現(xiàn)后，人們對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了非常廣泛的研究。已知PTEN的一個(gè)最重要的活性在于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)與增殖信號(hào)，抑制過(guò)強(qiáng)信號(hào)導(dǎo)致

2、的細(xì)胞惡性增生，在信號(hào)的正負(fù)平衡方面，起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用. PTEN不僅對(duì)磷脂具有去磷酸化活性，使IP3去磷酸化生成PIP2，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。而且對(duì)蛋白質(zhì)也具有去磷酸化作用，已有研究分析表明，PTEN去磷酸化的底物氨基酸殘基既包括絲氨酸和蘇氨酸也包括酪氨酸。最早發(fā)現(xiàn)的PTEN蛋白質(zhì)底物是FAK（focal adhesion kinase）。因而，PTEN又被稱(chēng)為雙性磷酸酶。與PTEN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)陰性調(diào)節(jié)相對(duì)應(yīng)，MA

3、PK家族在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)方面屬于陽(yáng)性調(diào)控，在經(jīng)典MAPK中，ERK5發(fā)現(xiàn)較晚、分子量相對(duì)較大，又稱(chēng)為BMK1，其由816個(gè)氨基酸構(gòu)成，位于氨基末端近一半氨基酸殘基構(gòu)成了激酶結(jié)構(gòu)域，其羧基末端包括兩個(gè)脯氨酸富集區(qū)、一個(gè)核定位信號(hào)和一個(gè)近末端的自動(dòng)磷酸化區(qū)域。ERK5信號(hào)途徑受應(yīng)激信號(hào)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子信號(hào)激活。功能范圍主要涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和調(diào)亡。ERK5受MEKK2/3-MEK5級(jí)聯(lián)激活，激活后的ERK5轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，直接激活其他轉(zhuǎn)錄因

4、子。因此，PTEN在細(xì)胞內(nèi)可能有著廣泛的底物，可能直接或間接調(diào)節(jié)ERK5的活性。而PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株，膜上有NGF受體，受生理水平NGF誘導(dǎo)后，它們停止分裂，長(zhǎng)出突起，分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞，常用于神經(jīng)系統(tǒng)的體外研究。因此，通過(guò)本課題的研究，我們可能在PTEN對(duì)ERK5途徑的各組分間對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控中以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)現(xiàn)新的治療靶位點(diǎn)，對(duì)臨床應(yīng)用具有很大的意義。
　　目的：通過(guò)比較確

5、定PTEN作用于Cot/Tpl-MEKK2/3—MEK5—ERK5信號(hào)通路的切入點(diǎn)，即PTEN通過(guò)哪個(gè)分子的去磷酸化，下調(diào)這一信號(hào)通路的活性。而后，實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步確定PTEN與靶目標(biāo)分子間的作用，再利用免疫共沉淀、GST-pulldown重點(diǎn)分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、PTEN與MEK5、PTEN與ERK5間的相互作用，確定PTEN調(diào)節(jié)ERK5信號(hào)通路的切入點(diǎn)以及PTEN沉默后對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響。
　　方法

6、：利用免疫共沉淀重點(diǎn)分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、MEK5和ERK5間的相互作用，通過(guò)比較確定PTEN作用于Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號(hào)通路的切入點(diǎn)；利用慢病毒穩(wěn)定感染技術(shù)，通過(guò)免疫印記（Western-blot）驗(yàn)證并檢測(cè)PTEN過(guò)表達(dá)后和沉默后，上、下游各信號(hào)分子磷酸化水平的變化，確定PTEN通過(guò)去磷酸化哪個(gè)分子來(lái)下調(diào)這一信號(hào)通路的活性；再通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，原核誘導(dǎo)表達(dá)GST-PTEN，然后

7、GST-pulldown PC12細(xì)胞裂解液，驗(yàn)證 PTEN作用的靶蛋白，以期確定 PTEN調(diào)節(jié)Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號(hào)通路對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響；此外，利用RayBio人類(lèi)RTK磷酸化抗體芯片，檢測(cè)PTEN過(guò)表達(dá)和沉默后受體酪氨酸激酶信號(hào)通路各因子的相對(duì)磷酸化水平，檢測(cè)PTEN可能作用的靶蛋白受體，探索可能受PTEN去磷酸化調(diào)控的與細(xì)胞分化相關(guān)的其他信號(hào)通路分子。
　　結(jié)果：在獲得PTEN穩(wěn)定過(guò)表

8、達(dá)和沉默的HEK293T細(xì)胞系后，通過(guò)Western-blot、免疫共沉淀及 GST-pulldown發(fā)現(xiàn)，PTEN沉默后，MEK5和ERK5的磷酸化水平增加，且PTEN能與MEK5、ERK5相互作用；通過(guò)計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)是PTEN沉默后HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)速度比PTEN過(guò)表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快；通過(guò)培養(yǎng)PTEN沉默的PC12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常的PC12突起生長(zhǎng)顯著；通過(guò)RayBiotech人類(lèi)受體酪氨酸激酶磷酸化抗體芯片

9、1檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PTEN沉默后，與PTEN沉默對(duì)照組相比，有四個(gè)因子EphB3、HGFR、MUSK、VEGFR2磷酸化水平上調(diào)，PTEN沉默后與PTEN過(guò)表達(dá)相比，有兩個(gè)因子Insulin R和VEGFR2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：⑴PTEN通過(guò)作用于MEK5間接調(diào)節(jié)ERK5活性，并同時(shí)直接作用于ERK5調(diào)節(jié)Cot/Tpl-MEKK2/3-MEK5-ERK5信號(hào)通路；⑵PTEN沉默后，能夠促進(jìn)HEK293T細(xì)胞的增殖；⑶PTEN