胞外Peroxiredoxin 2在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用研究.pdf

1、目的:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是三大腦血管疾病之一，致死率、致殘率高，危害極大。SAH后蛛網(wǎng)膜下腔中常常留有大量紅細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物，這些物質(zhì)可觸發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理改變，包括腦水腫、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞毒性作用等。而且，這些改變相互交錯、一起作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷、神經(jīng)功能障礙。
　　Peroxiredoxin蛋白家族(peroxiredoxins，Prxs)是一類真核細(xì)胞

2、中普遍存在的、起清除細(xì)胞內(nèi)過氧化物作用的抗氧化劑，同時介導(dǎo)調(diào)控過氧化氫水平的信號通路，并參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Prxs出胞后失去原有的細(xì)胞保護(hù)功能，所扮演的角色轉(zhuǎn)變。例如，當(dāng)腦缺血卒中發(fā)生后，Prxs釋放至細(xì)胞外，啟動嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，作用機(jī)制可能為通過Toll樣受體2(toll-like receptor2，TLR2)與Toll樣受體4(toll-like receptor4，TLR4)、激活核因子-κ B(nucle

3、ar factor-κ B，NF-κ B)途徑啟動損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)型炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷加劇，同時伴隨Prxs的進(jìn)一步釋放，促炎作用級聯(lián)放大，最終出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷結(jié)果。胞外的P rxs表達(dá)水平也會相應(yīng)升高。
　　而Peroxiredoxin2(Prx2)作為Prxs家族六個成員之一，在紅細(xì)胞中蛋白含量居第三（僅次于血紅蛋白），在神經(jīng)元中也有廣泛

4、表達(dá)。由于Prx2這一獨(dú)有的細(xì)胞分布特點(diǎn)，其在SAH后EBI中可能會扮演極其重要的作用。理由是:紅細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物是SAH后EBI的重要致傷因素，激活諸多損傷通路，而神經(jīng)元恰恰是這些損傷通路最終的靶細(xì)胞，因果交錯，作用疊加。
　　因此，我們提出假設(shè):當(dāng)SAH發(fā)生后，蛛網(wǎng)膜下腔中紅細(xì)胞會因衰老或腫脹等因素逐漸破裂、釋放出Prx2;腦組織中神經(jīng)元因缺血、炎性反應(yīng)等因素出現(xiàn)損傷、壞死也會釋放出Prx2，導(dǎo)致腦脊液、腦皮層間質(zhì)中Prx2(

5、即胞外Prx2)表達(dá)異常升高。這些胞外Prx2除了可能會直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷外，還可能會啟動、并介導(dǎo)DAMP型炎性反應(yīng)，加劇神經(jīng)元進(jìn)一步損傷，并伴隨Prx2進(jìn)一步釋放，作用級聯(lián)放大，最終在SAH后早期腦損傷中扮演極其重要的角色。
　　方法:本課題首先運(yùn)用Western-blotting技術(shù)觀察Prx2在紅細(xì)胞中表達(dá)情況，再運(yùn)用免疫熒光技術(shù)分別從體內(nèi)、體外觀察Prx2在各種腦細(xì)胞中分布，驗(yàn)證腦組織中Prx2是否僅在神經(jīng)元上表達(dá)。隨后

6、，采用兔枕大池一次注血方法建立大動物實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，用Western-blotting、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)技術(shù)檢測紅細(xì)胞裂解液組與紅細(xì)胞懸液組、對照組中腦組織中Prx2與腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中Prx2、炎性因子(IL-6、TNF-α)的含量，用免疫組織化學(xué)、Nissl染色、HE染色等技術(shù)觀察早期腦損傷及基底動脈痙攣

7、情況，初步得出胞外Prx2可能參與早期腦損傷作用中。其次，分別建立SAH體內(nèi)及體外模型，運(yùn)用Western-blotting、real-time PCR等技術(shù)觀察SAH后組織、原代神經(jīng)元及培養(yǎng)基中Prx2在各個時程表達(dá)水平的變化，以驗(yàn)證SAH后神經(jīng)元中Prx2表達(dá)水平是否上升及被釋放至胞外。然后，運(yùn)用Western-blotting、ELISA及細(xì)胞活性檢測(CCK8)等技術(shù)對胞外Prx2對小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)的激活（TLR4、Myd8

8、8及NF-κB表達(dá)上調(diào)）、炎性因子白介素6（interleu kin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的釋放及對原代神經(jīng)元的損傷等作用進(jìn)一步研究，闡述胞外Prx2在實(shí)驗(yàn)性SAH后早期腦損傷的作用機(jī)制。最后，回歸臨床，收集行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)及SAH患者的CSF，將CSF濃縮50倍后用于Western-blotting觀察Prx2的表達(dá)，然后分析CSF中Prx2水平與Hunt-Hess

9、分級的關(guān)系。
　　結(jié)果:體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明:Prx2在腦組織中僅神經(jīng)元廣泛表達(dá)，并在紅細(xì)胞中含量豐富。SAH后蛛網(wǎng)膜下腔中的紅細(xì)胞裂解、其胞內(nèi)Prx2將進(jìn)入CSF中，而神經(jīng)元中Prx2的mRNA水平早期迅速上調(diào)、蛋白表達(dá)隨后也明顯上升，隨著神經(jīng)元損傷、死亡、其胞內(nèi)Prx2也被釋放進(jìn)入培養(yǎng)基中，這兩者為胞外Prx2的來源。兔枕大池注射紅細(xì)胞裂解液實(shí)驗(yàn)顯示胞外Prx2表達(dá)與炎性因子含量正相關(guān)，并可能參與早期腦損傷作用中。隨后進(jìn)一

10、步研究發(fā)現(xiàn)，胞外Prx2既可以直接促進(jìn)神經(jīng)元死亡、凋亡外，也可以通過激活TLR4/NF-κ B通路、促進(jìn)炎性因子釋放，明顯加劇神經(jīng)元損傷，后者作用更為明顯。最后，臨床實(shí)驗(yàn)表明SAH后第3天患者CSF中Prx2含量升高，并與Hunt-Hess分級呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:本課題通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)再次證實(shí):Prx2在腦組織中僅神經(jīng)元廣泛表達(dá)，并在紅細(xì)胞中含量豐富。SAH后胞外Prx2含量上升，除直接促進(jìn)神經(jīng)元死亡外，更為重要的是通過激活T