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文檔簡介
1、目的:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是三大腦血管疾病之一,致死率、致殘率高,危害極大。SAH后蛛網(wǎng)膜下腔中常常留有大量紅細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物,這些物質(zhì)可觸發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理改變,包括腦水腫、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞毒性作用等。而且,這些改變相互交錯、一起作用,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷、神經(jīng)功能障礙。
Peroxiredoxin蛋白家族(peroxiredoxins,Prxs)是一類真核細(xì)胞
2、中普遍存在的、起清除細(xì)胞內(nèi)過氧化物作用的抗氧化劑,同時介導(dǎo)調(diào)控過氧化氫水平的信號通路,并參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Prxs出胞后失去原有的細(xì)胞保護(hù)功能,所扮演的角色轉(zhuǎn)變。例如,當(dāng)腦缺血卒中發(fā)生后,Prxs釋放至細(xì)胞外,啟動嚴(yán)重的炎性反應(yīng),作用機(jī)制可能為通過Toll樣受體2(toll-like receptor2,TLR2)與Toll樣受體4(toll-like receptor4,TLR4)、激活核因子-κ B(nucle
3、ar factor-κ B,NF-κ B)途徑啟動損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)型炎性反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷加劇,同時伴隨Prxs的進(jìn)一步釋放,促炎作用級聯(lián)放大,最終出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷結(jié)果。胞外的P rxs表達(dá)水平也會相應(yīng)升高。
而Peroxiredoxin2(Prx2)作為Prxs家族六個成員之一,在紅細(xì)胞中蛋白含量居第三(僅次于血紅蛋白),在神經(jīng)元中也有廣泛
4、表達(dá)。由于Prx2這一獨(dú)有的細(xì)胞分布特點(diǎn),其在SAH后EBI中可能會扮演極其重要的作用。理由是:紅細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物是SAH后EBI的重要致傷因素,激活諸多損傷通路,而神經(jīng)元恰恰是這些損傷通路最終的靶細(xì)胞,因果交錯,作用疊加。
因此,我們提出假設(shè):當(dāng)SAH發(fā)生后,蛛網(wǎng)膜下腔中紅細(xì)胞會因衰老或腫脹等因素逐漸破裂、釋放出Prx2;腦組織中神經(jīng)元因缺血、炎性反應(yīng)等因素出現(xiàn)損傷、壞死也會釋放出Prx2,導(dǎo)致腦脊液、腦皮層間質(zhì)中Prx2(
5、即胞外Prx2)表達(dá)異常升高。這些胞外Prx2除了可能會直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷外,還可能會啟動、并介導(dǎo)DAMP型炎性反應(yīng),加劇神經(jīng)元進(jìn)一步損傷,并伴隨Prx2進(jìn)一步釋放,作用級聯(lián)放大,最終在SAH后早期腦損傷中扮演極其重要的角色。
方法:本課題首先運(yùn)用Western-blotting技術(shù)觀察Prx2在紅細(xì)胞中表達(dá)情況,再運(yùn)用免疫熒光技術(shù)分別從體內(nèi)、體外觀察Prx2在各種腦細(xì)胞中分布,驗(yàn)證腦組織中Prx2是否僅在神經(jīng)元上表達(dá)。隨后
6、,采用兔枕大池一次注血方法建立大動物實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,用Western-blotting、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)技術(shù)檢測紅細(xì)胞裂解液組與紅細(xì)胞懸液組、對照組中腦組織中Prx2與腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中Prx2、炎性因子(IL-6、TNF-α)的含量,用免疫組織化學(xué)、Nissl染色、HE染色等技術(shù)觀察早期腦損傷及基底動脈痙攣
7、情況,初步得出胞外Prx2可能參與早期腦損傷作用中。其次,分別建立SAH體內(nèi)及體外模型,運(yùn)用Western-blotting、real-time PCR等技術(shù)觀察SAH后組織、原代神經(jīng)元及培養(yǎng)基中Prx2在各個時程表達(dá)水平的變化,以驗(yàn)證SAH后神經(jīng)元中Prx2表達(dá)水平是否上升及被釋放至胞外。然后,運(yùn)用Western-blotting、ELISA及細(xì)胞活性檢測(CCK8)等技術(shù)對胞外Prx2對小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)的激活(TLR4、Myd8
8、8及NF-κB表達(dá)上調(diào))、炎性因子白介素6(interleu kin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的釋放及對原代神經(jīng)元的損傷等作用進(jìn)一步研究,闡述胞外Prx2在實(shí)驗(yàn)性SAH后早期腦損傷的作用機(jī)制。最后,回歸臨床,收集行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)及SAH患者的CSF,將CSF濃縮50倍后用于Western-blotting觀察Prx2的表達(dá),然后分析CSF中Prx2水平與Hunt-Hess
9、分級的關(guān)系。
結(jié)果:體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明:Prx2在腦組織中僅神經(jīng)元廣泛表達(dá),并在紅細(xì)胞中含量豐富。SAH后蛛網(wǎng)膜下腔中的紅細(xì)胞裂解、其胞內(nèi)Prx2將進(jìn)入CSF中,而神經(jīng)元中Prx2的mRNA水平早期迅速上調(diào)、蛋白表達(dá)隨后也明顯上升,隨著神經(jīng)元損傷、死亡、其胞內(nèi)Prx2也被釋放進(jìn)入培養(yǎng)基中,這兩者為胞外Prx2的來源。兔枕大池注射紅細(xì)胞裂解液實(shí)驗(yàn)顯示胞外Prx2表達(dá)與炎性因子含量正相關(guān),并可能參與早期腦損傷作用中。隨后進(jìn)一
10、步研究發(fā)現(xiàn),胞外Prx2既可以直接促進(jìn)神經(jīng)元死亡、凋亡外,也可以通過激活TLR4/NF-κ B通路、促進(jìn)炎性因子釋放,明顯加劇神經(jīng)元損傷,后者作用更為明顯。最后,臨床實(shí)驗(yàn)表明SAH后第3天患者CSF中Prx2含量升高,并與Hunt-Hess分級呈正相關(guān)。
結(jié)論:本課題通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)再次證實(shí):Prx2在腦組織中僅神經(jīng)元廣泛表達(dá),并在紅細(xì)胞中含量豐富。SAH后胞外Prx2含量上升,除直接促進(jìn)神經(jīng)元死亡外,更為重要的是通過激活T
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