杜氏鹽藻（Dunaliella salina）14-3-3蛋白基因cDNA全長(zhǎng)的克隆與序列分析.pdf

1、14-3-3蛋白普遍存在于所有真核生物細(xì)胞中，它具有高度保守性，但又是功能復(fù)雜的同源或異源二聚體分子。1967年，Moore和Perez首次在牛腦細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種酸性、可溶的異源二聚體蛋白，并根據(jù)它們?cè)贒EAE-纖維素色譜上的組分?jǐn)?shù)以及在淀粉凝膠中的遷移率命名為14-3-3，其大小約為25-32KD，等電點(diǎn)為4-5。現(xiàn)已清楚它廣泛分布于從植物到哺乳類(lèi)的真核細(xì)胞內(nèi)。研究表明，14-3-3蛋白是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白家族，與癌基因或原癌基因產(chǎn)物結(jié)合參與

2、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，并能與許多功能不同的信號(hào)蛋白結(jié)合，例如蛋白激酶Raf-1、KSR-1、Bcr、Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶、PKC、蛋白磷酸酶cdc25c、促凋亡蛋白BAD、抗凋亡蛋白A20、跨膜蛋白受體GA等。因此它參與細(xì)胞許多重要的生理過(guò)程，并在其中起著至關(guān)重要的作用，如細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞的凋亡、免疫應(yīng)答、惡性腫瘤的形成等。 因此，無(wú)論是對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)科學(xué)、腫瘤發(fā)病機(jī)制，還是在植物生理機(jī)制及其對(duì)外界脅迫的反應(yīng)

3、，對(duì)它的研究都具有重要意義。此外，近來(lái)已有研究證實(shí)14-3-3蛋白通常具有阻止細(xì)胞凋亡的作用，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)抑制14-3-3與其他蛋白之間相互作用的多肽可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。而干擾14-3-3功能可能引起細(xì)胞快速增殖并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，由此提高傳統(tǒng)抗癌藥物的療效，靶向14-3-3蛋白也有望為治療腫瘤開(kāi)辟一個(gè)新途徑。 杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)歸屬于綠藻門(mén)，綠藻綱，團(tuán)藻目，杜氏藻科。是一種比較獨(dú)特的單細(xì)胞

4、綠藻，無(wú)細(xì)胞壁，含有一個(gè)大的“杯狀”葉綠體，能進(jìn)行光合作用，具有鞭毛，能游動(dòng)，可在0.05-5Mol/LNaCL培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，抗逆性極佳，是一種較為理想的抗逆境生存的生物，也是作為遺傳學(xué)研究的良好材料。并且用它作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服型疫苗或其他藥物，無(wú)須純化即可直接服用，大大降低生產(chǎn)成本。 選擇一些具有特征性的生物作為模式生物，研究高等生物復(fù)雜生命現(xiàn)象是生命科學(xué)研究的一種重要方法。目前已有多種生物被選做模式生物，如果蠅、酵母、線(xiàn)

5、蟲(chóng)等都是典型的模式生物。藻類(lèi)生物中萊茵衣藻也是一種很好的模式生物，杜氏鹽藻和衣藻同屬于綠藻門(mén)團(tuán)藻目，親緣關(guān)系相近，并且鹽藻還具有一些獨(dú)特的生物學(xué)特性。因此以鹽藻作為模式生物來(lái)研究14-3-3蛋白的功能及調(diào)控機(jī)制可能更具有特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。目前關(guān)于14-3-3蛋白及其基因的研究已在許多生物中開(kāi)展，但以鹽藻作為材料的還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在克隆鹽藻14-3-3蛋白基因，進(jìn)而研究其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等生命現(xiàn)象中的作用機(jī)制。也為調(diào)控鹽藻細(xì)胞的生長(zhǎng)

6、、建立鹽藻生物反應(yīng)器鑒定了基礎(chǔ)。 本研究首先以簡(jiǎn)并引物PCR的方法克隆了杜氏鹽藻14-3-3基因部分cDNA序列。根據(jù)此cDNA片段序列信息，利用RACE(RapidamplificationofcDNAends，cDNA末端快速擴(kuò)增)法分別向該基因的5'上游和3'下游進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了杜氏鹽藻14-3-3基因的5'和3'兩端序列。將上述各序列拼接設(shè)計(jì)引物，RT-PCR得到了杜氏鹽藻14-3-3基因的全長(zhǎng)序列。為研究14-3-3蛋

7、白的功能和機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 一、杜氏鹽藻14-3-3基因cDNA片段的克隆與分析1實(shí)驗(yàn)方法利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增杜氏鹽藻14-3-3基因cDNA片段根據(jù)GenBank上不同物種的14-3-3蛋白氨基酸序列，找出14-3-3蛋白的氨基酸高度保守同時(shí)核苷酸簡(jiǎn)并程度低的序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。以杜氏鹽藻總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再以此為模板，PCR擴(kuò)增14-3-3基因的cDNA片段。RT-PCR產(chǎn)物利用T-A克隆方

8、法，亞克隆到載體pMD18-T上，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank上其他物種的14-3-3基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并用BLAST進(jìn)行同源性分析。 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)序結(jié)果分析表明，RT-PCR得到的14-3-3cDNA片段長(zhǎng)為531個(gè)堿基，由其推導(dǎo)出的氨基酸序列包含177個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)BLAST分析證明，與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的14-3-3氨基酸序列有很高的同源性，其中與衣藻的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為94％

9、，與煙草的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為84％，與豌豆的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為84％，擬南芥的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為83％，與西紅柿的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為83％，與人的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為80％，由此可以判斷擴(kuò)增的片段為杜氏鹽藻14-3-3蛋白cDNA基因部分序列。 二、杜氏鹽藻14-3-3基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及序列分析1實(shí)驗(yàn)方法1.15'RACE

10、的方法擴(kuò)增14-3-3基因5'上游cDNA片段提取杜氏鹽藻細(xì)胞的總RNA，根據(jù)上述簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的杜氏鹽藻14-3-3基因部分cDNA片段序列信息，利用5'RACE的方法向5'上游區(qū)擴(kuò)增杜氏鹽藻14-3-3基因的5'cDNA末端片段。本實(shí)驗(yàn)利用5'-fullRACE試劑盒，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物環(huán)化(self-ligation)后，再利用基因特異引物分別進(jìn)行巢式PCR。擴(kuò)增結(jié)果即為包含部分已知序列的杜氏鹽藻14-3-3蛋白基因的5'上游未知序列片

11、段。擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對(duì)經(jīng)過(guò)篩選和鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。 1.23'RACE的方法擴(kuò)增14-3-3基因3'下游cDNA片段提取杜氏鹽藻細(xì)胞的總RNA，根據(jù)上述簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的杜氏鹽藻14-3-3基因部分cDNA片段序列信息，利用3'RACE的方法向3'下游區(qū)擴(kuò)增杜氏鹽藻14-3-3基因的3'cDNA末端片段。利用3'-fullRACE試劑盒，用oligodTAdaptorPrim

12、er逆轉(zhuǎn)錄mRNA得到第一條cDNA鏈，然后利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的基因特異引物1和接頭引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，為了增加特異性，再利用基因特異引物2和接頭引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果即為包含部分已知序列的3'端的未知序列片段。擴(kuò)增產(chǎn)物利用T-A克隆方法，亞克隆到載體pMD18-T上，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。 1.314-3-3基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及序列分析將已經(jīng)得到的14-3-3三段序列拼接，重新設(shè)計(jì)引物，利用RT

13、-PCR的方法，得到杜氏鹽藻的14-3-3全長(zhǎng)cDNA序列。 分別使用Dnaman軟件、Dnasis軟件以及GenBankBLAST檢索分析系統(tǒng)等對(duì)所擴(kuò)增的14-3-3基因全長(zhǎng)進(jìn)行氨基酸和核苷酸序列同源性以及密碼子偏好性等的分析。 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.15'RACE的方法擴(kuò)增14-3-3基因5'上游cDNA片段根據(jù)已知的14-3-3部分序列信息，利用5'RACE的方法擴(kuò)增14-3-3基因的5'上游序列，得到一個(gè)約260bp的序

14、列，除去非編碼區(qū)序列，推導(dǎo)出的氨基酸序列共有58個(gè)氨基酸殘基。序列中含有起始密碼子ATG。根據(jù)BLAST分析結(jié)果，顯示該氨基酸序列與其它物種14-3-3蛋白基因氨基酸序列有較高的同源性。 2.23'RACE的方法擴(kuò)增14-3-3基因3'下游cDNA片段根據(jù)已知的14-3-3部分序列信息，利用3'RACE的方法擴(kuò)增14-3-3基因的3'上游序列，得到一個(gè)約750bp的序列，除去非編碼區(qū)序列，推導(dǎo)出的氨基酸序列共有41個(gè)氨基酸殘基。

15、序列中含有終止密碼子TAA和poly(A)尾。根據(jù)BLAST分析結(jié)果，顯示該氨基酸序列與其它物種14-3-3蛋白基因氨基酸序列有較高的同源性。 2.314-3-3基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及序列分析測(cè)序結(jié)果分析表明，得到了14-3-3蛋白的全長(zhǎng)cDNA序列(該序列已在GenBank登錄，基因序列號(hào)為：AY965896)。它是一個(gè)1485bp的序列，含有一個(gè)完整的開(kāi)放讀碼框，全長(zhǎng)編碼區(qū)共774bp，推導(dǎo)的氨基酸序列有258個(gè)氨基酸

16、殘基。在將該氨基酸序列與GenBank已知物種的14-3-3氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析、比較后，顯示該氨基酸序列與其它物種14-3-3蛋白基因氨基酸序列有較高的同源性。 三、結(jié)論；1-克隆得到完整的14-3-3cDNA序列，全長(zhǎng)1485bp，包含一個(gè)完全的開(kāi)放讀碼框(774bp)，編碼一個(gè)全長(zhǎng)258個(gè)氨基酸的蛋白序列，該序列與Chlamydomonasreinhardtii(衣藻)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為89％

17、，與Nicotianatabacum(煙草)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為81％，Arabidopsisthaliana(擬南芥)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為80％，與tomato(西紅柿)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為77％，與Homosapiens(人)的14-3-3蛋白基因同源性為80％。 2.對(duì)杜氏鹽藻14-3-3密碼子使用偏好性的分析結(jié)果提示，在杜氏鹽藻14-3-3氨基酸序列中，具有兩種