AcMNPV病毒感染Sf9細(xì)胞引發(fā)自噬響應(yīng)的初步研究.pdf

1、細(xì)胞自噬（Autophagy）是機(jī)體的一種重要的保護(hù)機(jī)制。近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以幫助清除侵入到生物體細(xì)胞內(nèi)的微生物和病毒，發(fā)揮免疫作用。生物可通過(guò)自噬直接降解感染宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌或病毒或阻止病毒DNA的復(fù)制，即通過(guò)自噬響應(yīng)抵御細(xì)菌或病毒等微生物的入侵，而病原則可能發(fā)展出對(duì)抗甚至利用宿主自噬響應(yīng)的應(yīng)對(duì)機(jī)制，使之逃脫甚至利用細(xì)胞的自噬響應(yīng)。目前的研究表明，哺乳動(dòng)物和果蠅的病毒引發(fā)宿主的自噬響應(yīng)參與機(jī)體或細(xì)胞的免疫作用，但其誘發(fā)的自噬信

2、號(hào)通路和病原病毒抵抗自噬響應(yīng)的機(jī)制均為個(gè)性特征，對(duì)其是否存在共性機(jī)制目前尚無(wú)定論。
　　苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是鱗翅目昆蟲(chóng)草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的病原之一，目前尚無(wú)其感染宿主能否誘導(dǎo)自噬響應(yīng)及其相應(yīng)的機(jī)制的研究報(bào)道。本文以鱗翅目昆蟲(chóng)草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，以帶有識(shí)別標(biāo)記的GFP-Ac

3、MNPV和DsRed-AcMNPV二種重組病毒作為感染Sf9細(xì)胞的病毒，初步研究AcMNPV感染Sf9細(xì)胞是否誘發(fā)宿主的自噬響應(yīng)和病毒是否受到宿主自噬響應(yīng)抑制的影響？
　　本文實(shí)驗(yàn)主要獲得以下初步研究結(jié)果：
　　1.通過(guò)測(cè)定二種重組病毒 GFP-AcMNPV和 DsRed-AcMNPV病毒的滴度，得出GFP-AcMNPV病毒滴度 TCID50為1.26×106/mL，DsRed-AcMNPV病毒滴度 TCID50為9.35×

4、107/mL。兩種病毒感染 Sf9細(xì)胞后24h,熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果表明二種重組AcMNPV病毒都能夠感染草地貪夜蛾Sf9宿主細(xì)胞，并能在細(xì)胞中增殖。
　　2.在GFP-AcMNPV病毒感染Sf9細(xì)胞后12h、24h、36h和48h進(jìn)行Lyso-Tracker Red染色鏡檢發(fā)現(xiàn)：在病毒感染后24h、36h、48h三個(gè)時(shí)間段，細(xì)胞發(fā)生自噬溶酶體的數(shù)目均顯著增加。
　　3.在DsRed-AcMNPV病毒-Sf9細(xì)胞自噬響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中

5、：感染DsRed-AcMNPV病毒后48h①透射電鏡觀(guān)察到Sf9細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的自噬體雙層膜泡結(jié)構(gòu)；②成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pIEX-4-EGFP-BmAtg8后，熒光顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn) Sf9細(xì)胞內(nèi)聚集的綠色熒光斑點(diǎn)（EGFP-ATG8-PE）數(shù)目顯著增加；③Western blotting檢測(cè)證實(shí)：與對(duì)照相比，處理組的細(xì)胞中的EGFP-ATG8-PE蛋白質(zhì)的表達(dá)水平上調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明AcMNPV感染Sf9細(xì)胞后引發(fā)宿主細(xì)胞的自噬響應(yīng)。

6、r>　　4.Western blotting檢測(cè)感染紫外滅活的UV-DsRed-AcMNPV病毒的Sf9細(xì)胞中EGFP-ATG8-PE的表達(dá)，提示AcMNPV病毒衣殼蛋白是誘導(dǎo)Sf9宿主細(xì)胞自噬響應(yīng)的原因之一。
　　5.病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明，DsRed-AcMNPV病毒能夠在感染 Sf9宿主的自噬響應(yīng)中繼續(xù)繁殖，氯喹阻斷自噬小體向自噬溶酶體的融合后，病毒在宿主的繁殖被顯著上調(diào)，這暗示了病毒存在抵抗Sf9宿主自噬抑制的機(jī)制。