黃色粘球菌DK1622雙拷貝groELs基因的功能分析及應(yīng)用.pdf

1、GroEL屬于分子伴侶(molecular chaperone)中的伴侶素蛋白(chaperonin)家族,由于與真核生物中廣泛存在的HSP60無論在結(jié)構(gòu)還是功能上都幾乎一致,因此,其亦被稱為熱激蛋白。GroEL是一類作用比較廣泛的伴侶蛋白,其通常在胞內(nèi)幫助許多蛋白進行折疊、成熟和轉(zhuǎn)運。在E.coli中,約有10％-15％的蛋白是依賴于GroEL進行折疊的,因此其在任何溫度下都是菌體正常生長所不可或缺的。GroEL有如下三大特征:1)序

2、列的保守性:GroEL在真核生物、原核生物及古細菌中廣泛存在,且其在進化上高度保守,不同的種屬之間的CroEL表現(xiàn)出了極大的序列相似性,如:人類的HSP60與細菌的GroEL之間有超過55％的相似性,這一特性使它作為分類的依據(jù)逐漸被應(yīng)用到系統(tǒng)發(fā)生分析的工作中,以彌補16SrRNA在種水平上分辨率的不足；2)多拷貝性:在大約20％已經(jīng)測序的細菌基因組中都存在兩個或者兩個以上拷貝的groELs。groELs的多拷貝化源于進化過程中基因的復(fù)制

3、和水平轉(zhuǎn)移,而伴隨著這一過程的便是GroEL功能分化及多樣性,此即為GroEL的第三大特征。GroEL功能的多樣性往往具有菌株特異性,如在分支桿菌(Mycobacteria)的基因組中存在兩個拷貝的groELs,其中,groEL2是發(fā)揮持家功能的伴侶蛋白,因而是細胞正常生存所必須的,groEL1參與了霉菌酸(Mycolic Acid)的合成,當(dāng)其失活后,菌體雖然還能夠生存,但是不能生成成熟的生物膜；苜蓿中華根瘤菌(S.meliloti)

4、基因組中有多達5個拷貝的groELs,其中g(shù)roESL1與共生密切相關(guān),是持家的分子伴侶,而groESL5則主要參與應(yīng)激反應(yīng)。
　　 GroEL蛋白是一個由兩個背靠背的環(huán)組成的桶狀結(jié)構(gòu),其中每個環(huán)由7個相同的60kDa亞基組成,14個亞基包裹的空腔構(gòu)成了對底物蛋白進行折疊的圓桶狀的“加工室”,其輔伴侶蛋白(co-chalperone)GtoES是一個由7個約10kDa的亞基組成的同聚體蛋白,結(jié)構(gòu)上如同一個中部凸起的“房頂”,行使

5、功能時,其像一個蓋子一樣將OroEL頂部密閉。GroES同GroEL的結(jié)合一方面增大了GroEL折疊容量,另一方面,通過引發(fā)一系列的變構(gòu)效應(yīng)從而幫助GroEL完成對底物蛋白的釋放,因而在經(jīng)典模式中,GroES是GroEL助折疊機制中非常關(guān)鍵的一個因素。
　　 通常情況下,groEL基因前端存在groES輔伴侶蛋白基因,以groESL操縱子的形式存在。然而,在具有多個拷貝groELs基因的基因組中,groEL并不都是以完整的gro

6、ESL操縱子的形式存在,也就是說,某些拷貝groEL前端丟失了groES基因,于是有推測認為,groES基因的丟失是因為GroEL進化出了不依賴于GroES的作用方式。事實上,多種GroELs共用同一個groES基因的蛋白產(chǎn)物而發(fā)揮功能也可能導(dǎo)致某些拷貝groES基因的丟失,但這點尚未為實驗證據(jù)所證實。
　　 前期本實驗室在對纖維堆囊菌進行種水平上的分類工作中引入了groELs作為分類尺度,分析發(fā)現(xiàn)黃色粘球菌(M.xanthus

7、)DK1622基因組中分布有兩個拷貝的groELs,當(dāng)分別用兩個拷貝作為分類指標進行分類時,它們之間不會相互混雜,這提示了它們在進化上似乎是獨立的,因此二者的功能可能存在潛在的差異。進一步生物信息學(xué)分析表明,兩個拷貝基因的差異體現(xiàn)在諸多方面,首先:在組成結(jié)構(gòu)上,groEL1前端存在groES輔伴侶蛋白基因,以典型groESL操縱子的形式存在,而groEL2上游則缺失了groES基因,取而代之的是分布于其上下游的應(yīng)答調(diào)控元件；其次,在核苷

8、酸和氨基酸序列組成上,兩個拷貝分別有78.94％和83％的同源性,顯示出一些差異；再次,在可能的調(diào)控機制方面,groEL1基因簇前端存在兩個非常保守的CIRCE(Controlling Inverted Repeat for ChaperoneExpression)負調(diào)控元件,而groEL2在缺失groES時將其一并丟失,但其上下游卻廣泛分布有應(yīng)答調(diào)控元件。這些現(xiàn)象進一步加深了我們對于黃色粘球菌DK1622雙拷貝groELs基因差異性的

9、認識。
　　 本研究以黃色粘球菌DK1622雙拷貝groELs基因作為研究對象,通過對兩個基因進行缺失、構(gòu)建基因回補-失活突變株及報告基因融合表達菌株等方法,對兩個基因在菌株的生長、應(yīng)激等基本生物學(xué)過程及運動、攝食和發(fā)育等多細胞群體行為中的功能進行了考察,揭示了兩個拷貝groELs在粘細菌生活史中的功能及相互關(guān)系。進一步結(jié)合相容性質(zhì)粒共表達和基因串聯(lián)表達的方法建立了黃色粘球菌DK1622和纖維堆囊菌0157-2的CroEL助溶體

10、系,并利用粘細菌來源的HrcA蛋白作為助溶的模式底物,揭示了粘細菌中雙拷貝groELs共用同一個groES輔伴侶蛋白基因的可能性及兩種GroEL之間可能存在的底物特異性。
　　 在黃色粘球菌DK1622的生長和應(yīng)激反應(yīng)方面,兩個拷貝groELs之間體現(xiàn)出了一定的協(xié)作性?；蚴Щ畹膶嶒灲Y(jié)果表明,兩個拷貝groELs基因可以被分別失活；但兩個基因的雙失活對菌體是致死的,除非存在回補的groEL拷貝,否則雙拷貝groELs不可被同時失

11、活,因此任意一個拷貝groEL基因的存在是維持菌體存活所必須的。實時熒光定量PCR的結(jié)果進一步顯示,兩個基因在生長時期均表達,且除延遲期初期外,groEL1的表達量在生長階段的各個時期均較groEL2高；groEL1基因的敲除會引發(fā)groEL2基因的上調(diào)表達,這可能是單基因失活菌株的生長并未受到顯著影響的因為之一；而在groEL2敲除的菌株中,groEL1的下調(diào)表達會導(dǎo)致菌體的生長產(chǎn)生較為顯著地延遲,這些結(jié)果提示,雙拷貝groELs基因

12、均參與了菌株的生長過程,且二者在生長過程中的功能具有一定的互補性。應(yīng)激反應(yīng)方面,二者均參與了冷、熱、醇類、滲透壓、鹽等脅迫反應(yīng),在不同的脅迫條件下它們都表現(xiàn)出了不同程度的上調(diào)表達；在熱激反應(yīng)中,groEL2缺失會使菌體對熱激較野生型更為敏感,而groEL1缺失卻使菌體基本喪失對熱激的耐受性,但groEL1并不能使groEL2敲除菌株在受到熱沖擊后保持同野生型菌株同樣的長勢,因而對于熱激反應(yīng),兩個拷貝groELs基因的功能具有部分疊加。<

13、br>　　 兩個拷貝groELs基因功能的分化體現(xiàn)在多細胞群體行為中。在發(fā)育方面,groEL1缺失會導(dǎo)致菌體的生孢和發(fā)育產(chǎn)生嚴重缺陷,而groEL2則不然；在所選取的各個發(fā)育時間點,groEL1的表達量普遍較groEL2高,相對而言,groEL2在發(fā)育階段的表達更為恒定；將groEL2進行過表達能夠部分回復(fù)菌體的生孢和發(fā)育能力,但是仍然不及野生型菌株,因此,二者在生長階段表達量的差異是它們產(chǎn)生功能差異的因為之一。運動方面,groEL1

14、缺失會部分削弱菌體的A運動,無論groEL1還是groEL2的缺失都不影響菌體的S運動。攝食方面,groEL2缺失導(dǎo)致菌體對活菌的攝食能力受到顯著削弱,在以干酪素為營養(yǎng)的培養(yǎng)基中,groEL2敲除菌株的生長也較野生型菌株緩慢。因此,在粘細菌多細胞群體行為中,雙拷貝groELs具有一定的分工,groEL1參與了菌體的A運動,是菌體正常發(fā)育所必需的；groEL2則是菌體攝食不可或缺的。
　　 在構(gòu)建GroE1共表達助溶體系的過程中,

15、比較分析了基因共表達的三種策略,即:不相容質(zhì)粒共表達、同一啟動子串聯(lián)共表達和相容性質(zhì)粒共表達的優(yōu)劣,結(jié)果表明,利用帶有不同抗生素抗性的不相容質(zhì)粒進行基因共表達的穩(wěn)定性較差,利用同一個啟動子進行基因的串聯(lián)共表達對于兩個基因是有效的,相容性質(zhì)粒是進行基因共表達的最佳選擇。本實驗中結(jié)合相容性質(zhì)粒和基因串聯(lián)表達的方法初步建立了粘球菌DK1622和堆囊菌0157-2的GroEL助溶體系,并利用該體系成功實現(xiàn)了粘球菌DK1622來源HrcA蛋白的助