黃色粘球菌DK1622基因組的簡化.pdf

1、粘細菌是一類具有復雜多細胞社會學行為的革蘭氏陰性單細胞滑動細菌，能夠合成多種具有抗腫瘤、抗真菌、抗細菌、免疫調節(jié)等生物活性的天然產(chǎn)物。
　　 黃色粘球菌(Myxococcusxanthus，M.xanthus)DK1622是研究粘細菌多細胞群體行為以及遺傳與進化的陸生模式菌株，屬于孢囊桿菌亞目的粘球菌屬，不含內源性質粒，染色體為一條環(huán)狀雙鏈DNA，基因組序列全長為9.14Mb左右。其多細胞群體行為主要表現(xiàn)為雙運動系統(tǒng)支配的滑行運

2、動、子實體發(fā)育及粘孢子形成、自然環(huán)境中的群體捕食行為等。
　　 纖維堆囊菌（Sorangiumcellulosum）屬于堆囊菌亞目的堆囊菌屬，具有迄今為止發(fā)表的最大的原核生物基因組，是粘細菌中次級代謝產(chǎn)物數(shù)量最多、種類最為豐富的一個菌種。合成的次級代謝產(chǎn)物幾乎占所有已發(fā)現(xiàn)粘細菌種類的一半，且?guī)缀?00％的菌株都具有合成生物學活性物質的能力。
　　 埃博霉素(epothilone)即是纖維堆囊菌產(chǎn)生的一類大環(huán)內酯類聚酮化合

3、物，具有促微管聚合活性，是繼紫杉醇之后發(fā)現(xiàn)的作用于微管的抗腫瘤化合物中最令人興奮的研究熱點之一，是極具潛力的抗癌藥物。但是由于纖維堆囊菌自身存在著代時長(16h)、遺傳操作體系不成熟及遺傳背景不清晰等限制性因素，它的研究要遠遠落后于其它藥源微生物，埃博霉素的生物發(fā)酵也難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。為了解決這個難題，研究人員嘗試對埃博霉素進行了異源宿主表達，大腸桿菌、鏈霉菌、粘球菌因其代時短、遺傳背景清晰以及具有合成產(chǎn)物所需的底物和輔助酶等特點，常

4、被當做埃博霉素的異源表達載體。而作為異源表達的合適的“底盤”細胞，應具有精簡、健壯的基因組結構，即“最小”基因組，從而最大程度的降低噪聲干擾，從而提高所設計系統(tǒng)的可控性和可操作性。
　　 最小基因組是指在最適宜條件下維持細胞生長繁殖所必需的最小數(shù)目的基因，因此最小基因組研究的核心是確定基因的必需性。根據(jù)基因必需性的信息，可以采取“自上而下，top-down”的策略對現(xiàn)有的基因組進行有目的的精簡，刪除非必需的基因組片段。其中，用于

5、研究必需基因的方法主要有比較基因組學、大規(guī)?；蚴Щ顚嶒炓约盎诖x網(wǎng)絡的預測方法等。而在基因組精簡研究方面，目前的研究方法主要有基于自殺質粒的同源重組方法、基于線性DNA的同源重組方法、基于位點特異性重組酶的方法和基于轉座子的方法等。
　　 基于以上的研究背景和思路，為了能夠實現(xiàn)埃博霉素類化合物合成酶基因簇在粘細菌中的高效表達，我們嘗試用合成生物學最小基因組的理論方法來構建適于次級代謝產(chǎn)物表達的粘細菌底盤生物。
　　

6、首先，為了尋找DK1622基因組的非必需基因，我們通過生物信息學手段依次對DK1622基因組進行了比較基因組學分析，水平轉移而來的基因組島的預測以及次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的預測等分析。其中，通過比較基因組學的方法確定的黃色粘球菌DK1622的共有基因為:與另外兩種粘球菌(HW-1、124B02)比較，三者共有的基因數(shù)為5223個，占整個DK1622基因組的71.4％;與另外的10種粘細菌基因組(M.fulvusHW-1，M.fulvus

7、124B02，S.cellulosumSo0157-2,S.cellulosumSoce56,S.aurantiacaDW4/3-1,HaliangiumochraceumDSM14365,Anaeromyxobactersp.Fw109-5,Anaeromyxobactersp.K,Anaeromyxobacterdehalogenans2CP-C,Anaeromyxobacterdehalogenans2CP-1)比較，11種粘細菌

8、共有的基因數(shù)為955個，占整個DK1622基因組的12.03％。通過生物信息學軟件IslandViewer和IslandPath，我們在DK1622基因組中預測得到了19個通過水平轉移而來的基因組島，約占DK1622基因組全長的4.5％（李霞碩士完成）。通過生物信息學次級代謝產(chǎn)物合成相關基因簇預測軟件antiSMASH，我們在DK1622基因組中預測得到了22個次級代謝產(chǎn)物合成相關基因簇，片段大小總長度為1，283，071bp，約占DK

9、1622基因組全長的14％。
　　 隨后，為了進一步確定預測得到的基因組島和次級代謝產(chǎn)物合成基因簇是否真為黃色粘球菌DK1622的非必需基因，我們對基因組島（李霞碩士完成）和次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進行了逐個敲除，并對得到的敲除突變株的基本性質進行了分析。在確認了它們的非必需性后，我們對預測得到的基因組島進行了連續(xù)敲除，從而對黃色粘球菌DK1622基因組進行簡化，以期得到適于次級代謝產(chǎn)物表達的粘細菌的底盤生物。
　　 其中

10、，我們共得到了GI01-03、GI01-04雙缺失突變株，GI01-03-05三缺失突變株以及GI01-03-05-16四缺失突變株?；蚪M缺失片段大小分別為74689bp，54842bp，98923bp，131251bp。其中，四缺失突變株GI01-03-05-16的缺失片段大小占預測得到的基因組島總片段的34.91％，占整個DK1622基因組約1.44％。對連續(xù)敲除突變株的基本性質分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)敲除突變株的生長能力、運動能力和捕食能

11、力相較野生菌株DK1622沒有明顯的變化，而子實體發(fā)育和生孢能力相較于野生菌株DK1622則有較明顯變化:其中，連續(xù)敲除突變株GI01-03生孢能力約為野生菌株的23％;GI01-03-05、GI01-03-05-16的生孢能力略有降低;GI01-04的生孢能力基本不變。
　　 另外，對次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的必需性分析實驗中，我們共得到次級代謝產(chǎn)物合成基因簇敲除突變株4株(S6、S9、S12、S17)，并對得到敲除突變株的基本