低氧和高氧對斑馬魚胚胎心血管發(fā)育的影響.pdf

1、氧是需氧生物正常生命活動的必要條件，動物可通過調(diào)節(jié)自身代謝適應(yīng)短期的低氧或高氧環(huán)境。氧濃度變化會影響動物的生長發(fā)育和繁殖，尤其在心血管方面表現(xiàn)明顯。水中溶解氧容易發(fā)生改變，對水生動物的代謝影響顯著。魚類受高氧或低氧脅迫后會引發(fā)各種生理應(yīng)答，脅迫消除后機體會產(chǎn)生補償現(xiàn)象，但生長發(fā)育仍受影響，嚴(yán)重時誘發(fā)疾病并影響生存。目前溶氧對魚類影響的研究集中在成魚的生理響應(yīng)，對于胚胎發(fā)育時期的影響較少涉及。高氧和低氧條件下對胚胎生長發(fā)育、心血管發(fā)育情況

2、及調(diào)控機制尚不清楚。
　　本研究以斑馬魚(Danio rerio)作為實驗?zāi)Ｐ?，選擇心臟、血管熒光標(biāo)記的兩個品系斑馬魚為實驗材料，設(shè)定低氧(2.0±0.5mg/L)、常氧(6.0±0.5mg/L)和高氧(15.5±0.5mg/L)三種溶氧條件，用熒光顯微鏡觀測24-72hpf胚胎形態(tài)結(jié)構(gòu)，心臟和血管外部形態(tài)，心率，胚胎軀干部主要血管背主動脈(DA)和后主靜脈(PCV)直徑，背部縱向血管(DLAV)到PCV的距離，相鄰體節(jié)間血管(I

3、SV)距離，脊索旁血管(PAV)的形成情況。
　　結(jié)果顯示，常氧條件下胚胎存活率為74.18±4.23%，高氧下存活率為76±4.09%，而低氧下胚胎的存活率僅為43.98±1.94%。低氧不僅使滯后胚胎發(fā)育，且造成形態(tài)異常，如胚體較常氧短、頭部窄、眼小、卵黃吸收障礙、卵黃延伸延遲。高氧在一定時間內(nèi)促進胚胎發(fā)育，如發(fā)育到常氧組24h形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)時，所需時間為18-22h，而低氧條件下需要48-72h。高氧除誘導(dǎo)胚胎黑色素沉積增多，眼徑

4、增大(胚胎形態(tài)發(fā)育到48hpf時，常氧組和高氧組胚胎的眼徑分別為253.0±20.7μm和268.3±14.7μm)，其余體征與正常胚胎無異。低氧脅迫后的斑馬魚胚胎心包水腫、心管發(fā)育停滯，心臟雖有房室之分，但其卻不能向右環(huán)化。長時高氧導(dǎo)致心跳減弱，其余并無顯著影響。常氧和低氧組DA直徑分別為27.5±3.6μm和19.1±3.8μm，PCV直徑分別為35.7±5.4μm和23.0±5.8μm，PCV到DLAV距離分別為181.7±5.8

5、μm和143.7±16.5μm。由此可知，低氧使胚胎DA和PCV直徑變窄、PCV到DLAV距離變短。此外，低氧還導(dǎo)致ISV生長軌跡異常，PAV特異性消失。高氧僅增加DA直徑(30.8±5.0μm)，對其他血管無顯著影響。
　　為進一步探討低氧和高氧影響斑馬魚胚胎心血管發(fā)育的機制，使用整胚原位雜交(ISH)和qPCR檢測溶氧對心血管發(fā)育相關(guān)基因表達部位和表達量的改變。根據(jù)NCBI上的序列信息，使用PCR技術(shù)克隆心臟特異性標(biāo)記基因Cm

6、lc2、血管內(nèi)皮生長因子Aggf1、血管內(nèi)皮生長因子受體-3(Flt4/VEGFR-3)的cDNA序列，合成地高辛標(biāo)記的核酸探針用于ISH。通過qPCR檢測 Cmlc2、Aggf1、Flt4、血管內(nèi)皮生長因子受體-2(Flk1/VEGFR-2)及T-盒轉(zhuǎn)錄因子(T-box)家族中Tbx5表達量的變化。
　　心血管發(fā)育基因胚胎原位雜交結(jié)果表明，Cmlc2表達部位不受溶氧影響，但通過Cmlc2標(biāo)記觀察到低氧誘導(dǎo)心臟環(huán)化障礙。低氧和高氧

7、對Aggf1的表達部位及表達量無顯著影響。Flk1在低氧組胚胎的ISV血管表達特異性消失，高氧組表達無明顯變化。Flt4在低氧組胚胎頭部的表達缺失，但軀干部的表達增加，高氧組表達無明顯差異。相對qPCR結(jié)果表明：低氧和高氧使Cmlc2表達量下調(diào)，均具極顯著差異(P＜0.01)。Tbx5表達量上調(diào)，分別具有極顯著差異(P＜0.01)和顯著差異(P＜0.05)。Aggf1表達下調(diào)，均具有顯著差異(P＜0.05)。Flk1表達下調(diào)，均具有極顯

8、著性差異(P＜0.01)。Flt4表達表達上調(diào)，分別具極顯著差異(P＜0.01)和顯著差異(P＜0.05)。qPCR結(jié)果佐證了原位雜交中低氧脅迫的結(jié)果，同時檢測到高氧對這些基因的表達有影響。根據(jù)以上基因在心臟和血管發(fā)育中的功能，提示低氧可能通過Tbx5影響心臟的環(huán)化過程，心臟環(huán)化障礙是低氧引起心臟發(fā)育異常的始發(fā)環(huán)節(jié)。低氧可能通過VGEF/VGEFR途徑和Notch信號途徑影響胚胎血管的正常發(fā)育。盡管高氧對胚胎形態(tài)發(fā)育影響較小，但也可能通